马兰红 白 玲 李奇凤

(新疆儿童医院1 儿科，2 科教科，乌鲁木齐市 830000，电子邮箱；xingbabke@163.com)

支气管哮喘是多种炎症细胞(如肥大细胞、T淋巴细胞等)，以及多种炎症因子参与的慢性变态反应性疾病，其特征是发生气道高反应性[1]。儿童支气管哮喘的特点是起病急、症状重，病情不易控制，如病情长期迁延可导致哮喘反复发作，不利于儿童生长发育[2]。因此，深入研究支气管哮喘的发生与发展的机制，有助于寻找评估哮喘严重程度的指标及有效的治疗药物。支气管哮喘的病理生理表现为支气管局部大量炎症细胞浸润，且伴有大量炎症因子的释放，如Th1型细胞可产生γ-干扰素，而Th2型细胞能够分泌白细胞介素(interleukin,IL)-4及IgE，IgE诱导肥大细胞及嗜酸性粒细胞脱颗粒，进而释放组胺等介质，导致气道高反应性[3]。此外，炎症因子还可刺激气道平滑肌细胞增生肥大及气道纤维化等，引起气道重塑及气道狭窄的发生。解整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)33基因位于20p13，该基因编码13个外显子，编码的蛋白属于ADAM家族成员，具有ADAM家族共有的一个解体蛋白和金属蛋白酶结构域。ADAM33是膜锚定蛋白，参与了细胞-细胞和细胞-基质相互作用的各种生物过程，如受精、肌肉发育和神经发生等生理过程，以及肿瘤、炎症等疾病的发生和发展[4-5]。近年来有研究显示，ADAM33基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与支气管哮喘的易感性有关，其参与了支气管哮喘中气道高反应性的发生[6]。本研究通过检测支气管哮喘患儿血浆ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP，以及血浆γ-干扰素、IL-4、IgE的表达水平，分析ADAM33 rs678881及rs2853209与儿童支气管哮喘的易感性及其与γ-干扰素、IL-4、IgE的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月至2019年2月期间于我院儿科门诊诊治的238例支气管哮喘患儿作为哮喘组，其中男性115例、女性123例，年龄2～14(6.2±2.4)岁。纳入标准：(1)均为初次诊治，支气管哮喘诊断均符合《儿童哮喘诊断标准》[7]；(2)患儿1月内无呼吸道感染、泌尿系统感染等感染性疾病发生；(3)无严重心脏及其他肺部等疾病。排除标准：(1)近期应用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物的患儿；(2)合并过敏性紫癜等其他免疫性疾病的患儿；(3)患儿家属拒绝参加本研究。以同期进行健康体检的160例儿童作为对照组，其近1个月均无感染性疾病病史、无合并免疫性疾病或糖皮质激素用药史、无严重心肺疾病。其中男性88例、女性72例，年龄1～14(6.3±2.5)岁。哮喘组和对照组儿童的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 观察指标的检测

1.2.1 标本的获取及处理：取两组儿童晨起空腹静脉血约4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，其中2 mL全血用于提取外周血DNA，另外2 mL标本在4℃条件下2 000 r/min离心10 min分离血浆，用于检测血浆中γ-干扰素、IL-4、IgE水平。

1.2.2 ADAM33基因rs678881及rs2853209的SNP检测：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法进行检测。应用基因组DNA提取试剂盒(日本Takara公司，批号：KA5801CA)提取外周血DNA，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。应用NaroDrop2000超微量分光光度计(美国赛默飞公司)检测DNA的浓度及纯度，核酸电泳鉴定其完整性，置于-20℃冰箱保存。ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-3′，下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′；ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′，下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR总反应体系25 μL，包括模板DNA 0.2 mg，上下游引物各0.1 μmoL，12.5 mL PCR Master，双蒸水补足体系。PCR程序为在95℃下预变性3 min，94℃下变性30 s，60℃下退火45 s，72℃下延伸30 s，72℃延伸7 min，共45个循环。限制性内切酶的酶切反应总体体系10 μL，包括PCR产物8 μL，核酸限制性内切酶(EcoRⅠ)2 U，双蒸水补足体系。酶切反应条件为37℃水浴4 h。产物进行凝胶电泳，鉴定基因型。

1.2.3 血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平的检测：应用酶联免疫吸附法检测血浆中γ-干扰素、IL-4、IgE水平，试剂盒购自英国Abcam公司(货号：ab46025、ab215089、ab108650)，操作严格按照说明书进行 。

1.3 记录哮喘组的并发症发生情况 观察支气管哮喘患儿的消化道反应(包括腹痛腹泻、消化道出血、粪便隐血实验阳性)、纵隔或皮下气肿、呼吸衰竭、心律失常、肾炎等并发症的发生情况。

1.4 统计学分析 应用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验或方差分析；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用Logistic回归模型计算比值比(odds ratio,OR)以分析ADAM33基因rs678881、rs2853209位点各基因型、等位基因与儿童支气管哮喘易感性的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209基因型和等位基因的分布及其与支气管哮喘易感性关系 (1)ADAM33 rs678881： 哮喘组与对照组的ADAM33 rs678881 GC、CC及GG基因型比例差异有统计学意义(χ2=26.189，P<0.001)；与携带ADAM33 rs678881 GG基因型相比，携带GC、CC基因型的儿童更易发生支气管哮喘(均P<0.05)。哮喘组ADAM33 rs678881 C等位基因分布频率高于对照组(χ2=30.329，P<0.001)；与携带ADAM33 rs678881G等位基因相比，携带C等位基因型的儿童更易发生支气管哮喘(P<0.05)。(2)ADAM33 rs2853209 ：两组ADAM33 rs2853209各基因型比例以及等位基因分布频率比较，差异均无统计学意义(χ2=0.108，P=0.948；χ2=0.153，P=0.696)。见表1。

表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209位点各基因型、等位基因分布及其与支气管哮喘易感性的关系[n(%)]

2.2 两组研究对象血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平的比较 与对照组相比，哮喘组患儿血浆IL-4、IgE水平较高，而γ-干扰素水平较低(均P<0.05)，见表2。

表2 两组研究对象血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平的比较(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型哮喘组患儿的血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平的比较 ADAM33 rs678881各基因型患儿之间血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平差异均有统计学意义(F=34.011，P<0.001;F=9.637,P=0.001;F=103.882，P<0.001)，其中携带ADAM33 rs678881 GG、GC、CC基因型患儿血浆IL-4、IgE水平依次升高，而γ-干扰素依次降低(均P<0.05)。rs2853209各基因型患儿之间血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平差异均无统计学意义(F=0.535，P=0.591;F=0.393,P=0.677；F=2.064,P=0.130)。见表3。

表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型支气管哮喘患儿的血浆γ-干扰素、IL-4、IgE水平的比较(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型与支气管哮喘并发症发生情况的比较 与携带ADAM33 rs678881 GG基因型相比，携带GC、CC基因型支气管哮喘患儿的并发消化道反应发生率较高(均P<0.05)，而纵隔或皮下气肿、呼吸衰竭、心律失常、肾炎的发生率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表4。rs2853209各基因型支气管哮喘患儿的消化道反应、纵隔或皮下气肿、呼吸衰竭、心律失常、肾炎发生率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表5。

表4 ADAM33 rs678881各基因型支气管哮喘患儿的并发症发生情况的比较[n(%)]

表5 ADAM33 rs2853209各基因型支气管哮喘患儿的并发症发生情况的比较[n(%)]

3 讨 论

支气管哮喘是儿童常见的呼吸系统慢性疾病。近年来我国儿童支气管哮喘的患病率有逐渐增高的趋势，其不仅影响患儿健康，还给家庭及社会带来沉重负担[8]。多数支气管哮喘患者经规范、足疗程的支气管扩张剂和吸入激素治疗后病情可达到完全控制，但仍有部分患者的病情不能完全控制，特别是支气管哮喘患儿，治疗难度大，病情迁延易导致哮喘反复发作。因此，深入研究支气管哮喘的发病机制，寻找关键的诊断治疗靶点具有重要意义。支气管哮喘是一种与多基因遗传有关的疾病，受到遗传和环境等因素的影响，目前已发现多种支气管哮喘的易感基因，影响疾病的发生和发展[9]。ADAM33基因是近年来发现的新的支气管哮喘易感基因，其为ADAM家族成员，编码蛋白含800个氨基酸，包含许多保守的结构域等，如信号肽、金属蛋白酶、解整合素、跨膜结构域及细胞内糖蛋白结构域，通过相应结构域参与各种信号转导途径。研究表明，ADAM33蛋白在平滑肌细胞及间质细胞中表达丰富，而上皮细胞中表达量较低，ADAM33蛋白水解酶活性的提高与支气管哮喘发生时气道高反应性及肺功能下降关系密切，参与气道重塑等病理过程[10]。而ADAM33基因的SNP能影响支气管哮喘的遗传易感性[11]。因此，深入研究影响支气管哮喘发生和发展的ADAM33基因关键SNP位点，为防治支气管哮喘提供理论依据具有重要意义[12]。

本研究分析ADAM33 基因rs678881位点的SNP与支气管哮喘易感性的关系，结果显示，与对照组比较，哮喘组ADAM33 rs678881 GC、CC基因型比例以及C等位基因频率均更高(均P<0.05)；与携带ADAM33 rs678881 GG基因型、G等位基因相比，携带GC、CC基因型及C等位基因的儿童更易发生支气管哮喘(P<0.05)。这表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型与支气管哮喘的遗传易感性有关，C等位基因型增加儿童支气管哮喘的易感性[12]。分析原因可能是由于ADAM33 rs678881的基因位点位于基因启动子区CpG岛的位置，正常上皮细胞中CpG岛处于高甲基化状态，而间质细胞如平滑肌细胞中甲基化程度较低，支气管哮喘发生时该位点的SNP导致ADAM33基因甲基化程度减弱，促进该基因的表达，ADAM33进而参与促进气道高反应性及气道重塑性改变[5，13]。而本研究结果提示ADAM33 基因rs2853209位点的SNP未增加支气管哮喘患儿的遗传易感性，其机制尚不清楚，可能是该位点位于内含子区域，对ADAM33蛋白表达量及活性的影响不明显。

此外，本研究中携带ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支气管哮喘患儿血浆IL-4、IgE水平均明显高于携带GG基因型的患儿，而γ-干扰素水平均低于GG基因型患儿(均P<0.05)，表明ADAM33 基因rs678881的SNP可能与反映支气管哮喘严重程度的血浆指标γ-干扰素、IL-4、IgE水平有关，ADAM33基因rs678881的SNP也参与促进支气管哮喘的发展。其原因可能为：一方面，ADAM33 基因的表达受到气道炎症程度的调控。研究显示，支气管哮喘发生时，Th2类细胞因子如IL-4、转化生长因子β能够直接促进ADAM33 基因的表达，促进成纤维细胞的分化及增殖，导致气道重塑[14]，而抑制ADAM33 基因表达的γ-干扰素显著下调，进一步促进成纤维细胞的增殖[15]。另一方面，ADAM33本身具有金属蛋白酶活性，能够促进膜结合的生长因子及其相应受体的释放，如表皮生长因子及其受体、胰岛素生长因子及其受体等，促进T细胞向Th1和Th2亚型分化，促进Th2亚型IL-4的表达，招募并活化B细胞产生IgE[16-17]。因此，ADAM33与γ-干扰素、IL-4等炎症介质间可能存在正反馈环路，共同促进支气管哮喘的发展。

本研究进一步分析ADAM33基因rs678881及rs2853209位点各基因型与支气管哮喘患儿并发症的关系，结果显示携带ADAM33基因rs678881 GC、CC基因型支气管哮喘患儿的消化道反应的发生率高于GG基因型(P<0.05)，而不同rs2853209基因型患儿间的并发症的发生率差异并无统计学意义，表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能有助于判断支气管哮喘患儿有无消化道反应的发生，其原因可能是rs678881 GC、CC基因型患儿的机体处于炎症反应状态较重，引起胃肠道功能紊乱，导致呕吐、腹泻等临床症状[18]。

综上所述，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型及C等位基因增加支气管哮喘患儿的易感性，而rs2853209基因SNP可能与支气管哮喘患儿的易感性无关。同时，携带ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支气管哮喘患儿血浆IL-4、IgE水平较高而γ-干扰素水平较低，且消化道反应的发生率高，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能参与了儿童支气管哮喘的发展。但本研究样本量较小，未能考虑环境因素对支气管哮喘的影响，因此有待进一步研究以验证ADAM33基因SNP对儿童支气管哮喘发生与发展机制的影响。