米垚川， 温滨红

辽宁省人民医院 内分泌科，辽宁 沈阳 110016

成人的血管平滑肌细胞的主要功能是维持血管收缩并控制血管直径，以调节血压的血流分布[1-2]。收缩表型的血管平滑肌细胞表达分化标志物如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是血管平滑肌细胞维持收缩表型的必需蛋白[3]。当受到高糖、高血脂及高血压等病理因素刺激时，血管平滑肌细胞表现出显著可塑性，从收缩型向合成型转变，其特征是收缩型蛋白的表达降低以及合成型蛋白的表达增加[4-5]。血管平滑肌细胞的表型转换与动脉粥样硬化的发病有关，后者为2型糖尿病的重要并发症之一[6]。瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一种配体门控非选择性阳离子通道蛋白，对Na+，Ca2+和Mg2+等离子具有显著的通透性[7]。在改善动脉粥样硬化方面，TRPV1发挥至关重要的调节作用[8-9]。但目前关于TRPV1是否影响由高糖诱导的血管平滑肌细胞表型转换鲜有报道。基于此，本研究以期通过实验阐明TRPV1对血管平滑肌细胞表型转换的作用与机制。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 健康8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠20只，购自维通利华实验动物技术有限公司，体质量(23.00±0.23)g。实验动物饲养及取材均严格遵守实验动物管理及保护相关规定。

1.2 主要材料及试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶购自Invitrogen公司；青链霉素混合液、胎牛血清购自Gibco公司；葡萄糖试剂购自Sigma公司；TRPV1、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、α-SMA抗体均购自Abcam公司；过表达腺病毒载体AdTRPV1(病毒滴度为1.4×1010PFU/ml)、阴性对照腺病毒载体AdGFP购自和元生物技术股份有限公司。

1.3 原代血管平滑肌细胞分离和培养 组织贴块法培养小鼠原代血管平滑肌细胞：小鼠麻醉后处死，置入酒精缸中消毒3 min，后置于无菌手术台，充分显露胸腹部后用眼科剪切开皮肤；打开胸腔，选取主动脉弓到腹主动脉的血管，PBS反复冲洗后，去除血管外的结缔组织及脂肪组织，并在剪开血管后刮除内皮细胞；再次PBS冲洗，将剩余的血管剪成约1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，将组织块平均分布在培养皿底部，加入含10%血清的DMEM培养基4 ml，放入37℃ 5%CO2培养箱中；4～6 h后翻转培养瓶，加入含10%血清的DMEM培养基8 ml，静置培养4～5 d，每3 d换液1次，观察血管平滑肌细胞从组织块迁出的情况并传代培养。取第3代以后血管平滑肌细胞种植于6孔板中，分别转染AdTRPV1或AdGFP，24 h后于荧光显微镜下观察转染效率。

1.4 划痕实验 细胞转染成功后，利用2.5 μl移液器枪头垂直均匀划痕，后采用2.0 ml PBS清洗。实验细胞通过给予25 mmol/L葡萄糖持续48 h形成高糖刺激；通过给予5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇持续48 h形成对照。即血管平滑肌细胞转染AdTRPV1或AdGFP后，再通过高糖刺激或对照处理，最终分为4组：AdTRPV1对照组、AdGFP对照组、AdTRPV1+高糖组与AdGFP+高糖组。分别于37℃，5%CO2培养箱培养0、24 h后，显微镜下观察并拍照记录。每次显微镜观察前用无血清培养基清洗，除去细胞碎片。根据公式：细胞迁移率=(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%，计算细胞迁移率。

1.5 Western blotting法检测TRPV1及相关表型转换蛋白表达 血管平滑肌细胞经过处理后，将细胞从培养皿底部刮下，转移至EP管中，加入裂解液，提取细胞蛋白并进行定量，计算并配置相应的上样量，通过10% SDS-PAGE凝胶行蛋白电泳，蛋白分离后常规转膜，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜，第2天TBST洗涤3次，加入对应的二抗后室温孵育2 h，TBST洗涤4次，采用Amersham Imager 680化学发光成像仪扫描并记录分析条带灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞迁移率比较 AdGFP对照组与AdTRPV1对照组迁移率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；AdGFP+高糖组的迁移率明显高于AdGFP对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AdTRPV1+高糖组的迁移率明显低于AdGFP+高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 划痕实验检测TRPV1对血管平滑肌细胞在高糖刺激下的迁移率影响

2.2 各组细胞中TRPV1及表型转换相关蛋白表达比较 AdTRPV1对照组与AdGFP对照组的TRPV1、α-SMA和OPN表达情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)；AdGFP+高糖组的TRPV1、α-SMA表达低于AdGFP对照组，OPN表达高于AdGFP对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AdTRPV1+高糖组的α-SMA表达高于AdGFP+高糖组，OPN表达低于AdGFP+高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 Western blotting检测表型转换相关蛋白OPN、α-SMA及TRPV1表达(a.电化学发光法显示蛋白印迹；b.相对蛋白含量量化分析)

3 讨论

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，与非糖尿病相比，糖尿病患者合并心血管疾病的比例显著升高。既往研究表明，在高糖刺激下，血管平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型，并导致动脉粥样硬化等病理现象的发生与发展[10]。有研究表明，应用白细胞介素-6单克隆抗体Tocilizumab可抑制高糖引起的血管平滑肌细胞表型转换，并产生抗动脉粥样硬化的效应[11]。另一项国外研究表明，MiR-381-3p通过靶向HMGB1，抑制了由高糖刺激引起的血管平滑肌细胞表型转换[12]。然而，目前临床措施干预由高糖引起的多种血管疾病效果欠佳。因此，寻找有效的干预靶点，抑制血管平滑肌细胞在高糖刺激下发生表型转换，进而减少心血管并发症至关重要。

TRPV1在心血管系统中发挥重要的作用。有研究表明，TRPV1激活显著降低自发性高血压小鼠来源的血管平滑肌细胞中磷脂酰肌醇3-激酶的活性和蛋白激酶B的磷酸化水平，减轻颅内小动脉重塑[13]。本研究结果显示，AdGFP+高糖组的迁移率明显高于AdGFP对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AdTRPV1+高糖组的迁移率明显低于AdGFP+高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见，TRPV1对由高糖诱导的血管平滑肌细胞迁移率的增加具有重要调控作用。本研究结果还显示，AdGFP+高糖组的TRPV1、α-SMA表达低于AdGFP对照组，OPN表达高于AdGFP对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AdTRPV1+高糖组的α-SMA表达高于AdGFP+高糖组，OPN表达低于AdGFP+高糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见，TRPV1可逆转由高糖诱导的血管平滑肌细胞收缩型蛋白标志物水平的下降，同时抑制血管平滑肌细胞向分泌表型转换。

综上所述，血管平滑肌细胞在高糖诱导下，TRPV1表达下调，血管平滑肌细胞由收缩型转化为分泌型，平滑细胞发生表型转换，过表达TRPV1可改善由高糖诱导的血管平滑肌细胞表型转换。