张 雷,朱稀雯,何 堃,龚建平,彭自力△

(1.重庆市奉节县人民医院肝胆外科 404600；2.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 400010)

含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)是由NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)和pro-半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)组成的蛋白复合体，是NLR家族中目前研究最明确的成员。它能被多种分子、细菌或病毒激活，促进白细胞介素(IL)-18、IL-1β等炎性因子的成熟与分泌，与痛风、2型糖尿病、阿尔茨海默病、非酒精性脂肪肝等炎性疾病有关[1]。

自噬对机体的正常运转必不可少，其参与了机体免疫应答并对炎性反应进行调节。有研究证实，在棕榈酸(PA)导致的肝细胞凋亡中，自噬可对细胞起保护作用[2]。还有报道称自噬可以通过降解NLRP3炎症小体抑制IL-1β的产生[3]。P62是自噬最主要的结合蛋白,它含有TRAF6结合域(TB)，LC3互相作用区域(LIR)及泛素结合区域(UBA)。因此，其可以和多聚泛素化链结合，识别泛素化底物并运至自噬体[4]。

在非酒精性脂肪肝中P62是否可以介导并识别ASC的泛素化，从而促进NLRP3炎症小体降解还有待证实。因此，本实验将检测PA刺激Kupffer细胞(KCs)后，P62与ASC的互相作用及泛素化水平，探讨自噬体对炎症小体蛋白的调控机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

NLRP3、ASC和β-actin抗体(武汉三鹰公司产品)，LC3抗体(美国Cell Signaling公司产品)，P62/SQSTM1、Beclin-1抗体(美国Abcam公司产品)，Anti-Ubiquitin抗体(美国Millipore公司产品)。蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。IL-1β ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠肝脏KCs的分离及处理

小鼠异氟烷吸入麻醉，消毒后逐层开腹，显露肝脏及门静脉，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)5 mL由门静脉灌注肝脏至黄褐色。……