3个基因共调控下莱茵衣藻的转录组分析

2021-03-17李小连殷剑波林永祺彭小波

深圳大学学报（理工版） 2021年2期

黄瑛，李小连，殷剑波，林永祺，彭小波，贾彬

深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境科学重点实验室，广东省海洋藻类生物工程技术研究中心，广东深圳518060

三酰甘油(triacylglycerol, TAG)是自然界中脂肪的主要成分，其基本组成单位为脂肪酸(fatty acid, FA)，是生物柴油、食用油等油制品的组成成分．TAG的生物合成通路包括脂肪酸的合成途径及肯尼迪途径(Kennedy pathway)[1]．同时，TAG和FA的分解代谢产物也为脂肪的合成提供乙酰辅酶A．此外，脂肪代谢还与糖类和蛋白质的代谢通过乙酰辅酶A、丙酮酸等中间代谢产物建立了紧密的联系，形成复杂的碳氮代谢网络．目前，单基因调控下提高工程藻株脂肪积累的研究已取得一定的进展，长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)参与FA的合成、活化与β-氧化，沉默cracs2基因后莱茵衣藻细胞内的TAG质量较野生型提高了55%[2].在三羧酸循环中，草酰乙酸和乙酰辅酶A在柠檬酸合酶(citrate synthase, CIS)的作用下形成柠檬酸，是关键的节点反应．有研究表明，cis的沉默使得莱茵衣藻的TAG增加了169.5%[3].DOF(deoxyribonucleic acid binding with one finger)转录因子介导植物的种子萌发和碳氮代谢等代谢过程，在莱茵衣藻中过表达DOF转录因子后，胞内总脂肪酸的含量为126.01 μg/mg，提高了23.24%[4]．但关于构建多基因工程藻株以提高脂肪含量的报道较少，且对于碳氮代谢网络中的脂肪合成调控机制有待深入研究．

莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhartii)为光合微藻中的模式生物，具有光合效率高、繁殖速度快、易于培养等优势，适合于构建高产脂质的工程藻株．转录组测序技术是揭示基因调控网络的有效手段[5-6]，莱茵衣藻的脂质代谢网络错综复杂，且缺乏与调控机制相关的转录组信息，这有碍于相关基因的功能挖掘．本研究对3基因共调控下的莱茵衣藻藻株DLC(沉默acs2和cis1基因，且过表达DOF转录因子)进行了转录组测序以及差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)分析，进一步揭示多基因调控网络下莱茵衣藻脂质合成调控的分子机制，为提高微藻脂质产量的基因调控工程提供理论基础．

1 实验

1.1 材料与培养条件

莱茵衣藻C.reinhardtiiCC849购自美国衣藻资源中心．C.reinhartiiDLC藻株[7]来自深圳大学生命与海洋科学学院实验室，转入了含acs2-cis1反向重复片段的pmaa7/XIR沉默载体，以及含dof表达片段(受RBCS2-HSP70A热激启动子调控)的pJD表达载体．大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli) Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司．

利用三羟甲基氨基甲烷醋酸盐-磷酸培养基，将藻株于25 ℃、100 μmol/(m2·s)光照强度条件下培养．待培养至对数期，于水浴锅中40 ℃热激30 min，室温下恢复1 h后提取总核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)以进行转录组测序．样品组包括无热激处理工程藻株(DLC)、野生型藻株(WT)、热激处理工程藻株(HDLC)及热激处理野生型藻株(HWT)，各组分别设置3个生物学重复．待继续培养至第6天进行TAG及淀粉的检测．

1.2 TAG含量的检测

BODIPY 505/515为油脂荧光染料，其与藻细胞内的脂滴结合后在激光照射下发绿色荧光，故荧光强度的高低直接反映胞内TAG的含量，检测过程为：① 取1.5 mL的藻液，于5 000 r/min离心5 min回收藻细胞；② 用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)(0.01 mol/L)冲洗2～3 遍后，4 000 r/min离心2 min；③ 通过血球计数板计数，用PBS将体系稀释至2×106～6×106/mL；④ 取980 μL的稀释藻液至流式细胞仪(BD Bioscience)的细胞管中，再取20 μL含10 μg/mL BODIPY 505/515 染液(Thermo Fisher Scientific)的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液加入；⑤ 以不加染液的藻液为阴性对照，在异硫氯荧光素(fluoresceinisothiocyanate, FITC)通道中，激发光480 nm、发射光510 nm下对1×105个细胞进行荧光值读数．

1.3 淀粉含量的测定

① 取5 mL藻液离心(12 000 r/min，10 min)，弃上清；② 取700 μL经淀粉提取试剂盒(Solarbio)提取后的提取液，加入100 μL蒸馏水稀释8倍；③ 标准曲线的制作：采用酶标仪分别检测0.2、 0.1、 0.05、 0.025、 0.012 5、0.006 25、0.003 125及0.001 56 mg/mL的葡萄糖标准溶液在620 nm处的吸光度；以标准溶液的质量浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，据此得到线性函数方程；④ 在样品测量前先检测标准品以校正：混合0.2 mL标准品溶液与1 mL 淀粉提取剂，95 ℃下水浴加热10 min，待冷却后以同体积蒸馏水的吸光度为空白对照值,分别测定标准品的吸光度,并与据标准曲线函数计算出的葡萄糖浓度进行比较校准；⑤ 测定各组样品提取液在620 nm处的吸光度，将依照标准曲线函数计算所得的淀粉质量浓度ρ值(单位：mg/mL)代入式(1),即可计算出各样品(鲜质量)中的淀粉质量分数w(单位：mg/g).

w=ρVn/m

(1)

其中，V为稀释后淀粉提取液的体积(单位： mL)；m为样品藻细胞的鲜质量(单位： g);n为稀释倍数．

1.4 总RNA的提取与转录组数据的获取

利用RNAiso Plus(Takara)试剂盒提取各组样品的总RNA，经超微量分光光度计(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific)测定RNA浓度和纯度，以及质量浓度为10 g/L的非变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的质量后，构建互补核糖核酸(complementary dexyribonucleic acid, cDNA)文库，并委托华大基因测序，每个样品组分别进行3次重复测序．

1.5 转录组数据的生物信息学分析

1.5.1 原始数据处理及参考基因组比对

文库测序完成后得到原始数据(raw reads)，通过SOAP nuke软件(v 1.4.0)进行统计，并使用软件Trimmomatic(v 0.36)进行数据过滤，排除带有测序接头、未知碱基数量大于5%和质量低的数据(reads)，得到过滤后数据(clean reads)；利用HISAT2 软件[8](v 2.1.0)与参考基因组进行比对，使用Bowtie2软件[9](v 2.2.5)与参考基因比对，采用RNA-seq by expectation maximization(RSEM)软件包[10](v 1.2.8)计算基因表达丰度，并以FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)表示．

1.5.2 差异表达基因的筛选与富集分析

使用华大基因Dr.Tom系统进行差异表达基因分析，设定差异表达倍数(fold change)≥ 2、Q值(校正后的P值)≤0.001，得到初步的DEGs；再进一步筛选HWT藻株中FPKM值大于等于1.5的DEGs，并据京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)的注释结果及官方分类对DEGs进行通路聚类及富集分析．

2 结果与分析

2.1 TAG及淀粉含量的变化

经BODIFY 505/515染色法检测，发现DLC藻株的荧光强度较WT藻株升高了70%(图1)，且HDLC藻株的荧光强度较HWT藻株提高了118%，说明3基因的共调控能促进莱茵衣藻细胞内的TAG合成． HDLC藻株的荧光强度较DLC藻株提高了77%，且HDLC藻株的荧光强度较WT藻株提高了193%，说明热激诱导进一步增强dof基因的过表达后，3基因的共调控使得莱茵衣藻细胞内的脂质合成进一步显著增强．

**为P< 0.01, t 检验 (n=3)图1 莱茵衣藻内TAG含量的变化Fig.1 TAG content of C.reinhardtii

DLC与WT藻细胞中的淀粉质量分数分别为122.99 mg/g和134.29 mg/g，二者无显著性差异，但HDLC藻株中的淀粉质量分数比HWT藻株的少了30%(图2)，而HDLC藻株中的脂质质量较高，说明3基因共调控藻株中的碳流发生了重新定向，使得糖类合成通路中的代谢物流向脂质合成通路中被利用．

2.2 差异表达基因的统计

将WT、HWT和HDLC三组藻细胞的转录组信息进行比对．WT与HWT、HWT与 HDLC两组之间统计得1 665个共同的DEGs，其中，FPKM值≥1.5的DEGs有749个，543个为上调基因，206个为下调基因．

2.3 差异表达基因的KEGG聚类与富集分析

差异表达基因的KEGG pathway分类结果如图3，分别有51个和15个DEGs参与碳水化合物代谢与脂质代谢．

进一步对这两种代谢途径中的DEGs进行富集分析，结果如图4．由图4可见，在碳水化合物代谢中，富集在糖酵解及糖异生的DEGs编码乙酰辅酶A合成酶、丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸异构酶等；富集在淀粉与蔗糖代谢的DEGs编码内切葡聚糖酶、1, 3-β-葡聚糖合酶和果胶酯酶等；此外，还有DEGs富集在三羧酸循环和光合有机体中的碳固定等代谢过程．

图3 差异基因的KEGG聚类分析Fig.3 KEGG pathway classification of differentially expressed genes

图4 差异基因在碳水化合物代谢通路中的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of differentially expressed genes in carbohydrate metabolism

由图5可见，在脂质代谢过程中，富集在甘油三酯代谢的DEGs编码醇脱氢酶等；富集在甘油磷脂代谢的DEGs编码溶血磷脂酶Ⅱ和乙醇胺-磷酸胞苷转移酶等；富集在脂肪酸降解的DEGs编码乙酰辅酶A-乙酰基转移酶和酰基辅酶A氧化酶Ⅰ等；还有DEGs富集在脂肪酸碳链延伸过程．通路中富集的关键DEGs的分布及其注释信息如表1，其中，N为差异倍数．

图5 差异基因在脂质代谢通路中的集分析Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes in lipid metabolism

表1 脂质及碳水化合物代谢途径中关键差异表达基因的注释

上述脂质代谢调控网络中关键基因表达水平的变化，进一步表明3基因调控下莱茵衣藻细胞内脂质含量的增加，不仅是由于脂质合成代谢的增强，还可能是因为甘油酯和脂肪酸降解等以脂质为起始反应物的途径被弱化．此外，还可能是由于糖类等其他非脂物质的生物合成途径减弱，使得更多的共同代谢中间物流向脂质合成途径而被充分利用．

3 讨论

脂质合成代谢中的甘油三酯代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢等途径与糖代谢中的糖酵解、糖异生和淀粉代谢等途径相关联，因此，若其他代谢通路含有生成三磷酸甘油、甘油、乙酰辅酶A和脂肪酸等共同中间代谢产物，则能在一定的调控条件下改变碳流的偏向，促进脂质合成代谢． ACS2和CIS1分别参与脂质合成及糖代谢中的关键反应，而DOF转录因子介导碳氮代谢中多通路的调控，则3基因的共同调控定能引起其他关键基因表达水平的变化．

在甘油三酯代谢中，醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)能将甘油氧化为D-甘油醛，再被甘油脱氢酶催化为甘油．有研究表明，编码ADH及乙酰乙酸脱羧酶等参与乙酰辅酶A代谢的基因的共同过表达导致大肠杆菌内的脂肪酸异丙基酯达203.4 mg/L[11]．与WT藻细胞相比，ADH在HWT 藻细胞中的表达水平下降；而相比于HWT藻细胞，ADH在HDLC中表达水平上调，说明3基因调控下ADH的上调可能导致甘油的增加而增强脂质合成代谢．

在甘油磷脂代谢中，三磷酸甘油是重要的中间产物．相较HDLC藻细胞中溶血磷脂酶Ⅱ(lysophospholipase Ⅱ, LYPLA2)及乙醇胺-磷酸胞苷转移酶2(phosphate cytidylyltransterase 2, PCYT2)的表达量增加，LYPLA2以2-酰基甘油-3-磷酸胆碱为底物，催化生成甘油-3-磷酸胆碱，随后被转化为三磷酸甘油；而PCYT2将磷酸乙醇胺转化为CDP-乙醇胺，产物经接连反应后被转化为三磷酸甘油．WEPY等[12]发现LYPLA1和LYPLA2共同调控神经细胞脂质代谢的平衡，任何一方的活性缺失均会导致溶血磷脂的增加；PAVLOVIC等[13]则发现pcyt2的沉默导致小鼠胚胎细胞内磷脂酰乙醇胺合成的提高，使得膜脂增加．因此，热激后3基因的调控下LP2、 PCYT2的表达上调可能抑制膜脂的合成,使得脂质的生物合成进程偏向三酰甘油的合成．

在脂肪酸降解途径中，乙酰辅酶A是由脂肪酸β-氧化和糖酵解终产物丙酮酸经氧化脱羧产生的，在有机体中的许多代谢过程中发挥着关键的作用．β-氧化的连续周期反应过程中，每一步反应中长链脂肪酸脱去含两个碳原子的碎片而被氧化为逐缩短碳链的脂酰辅酶A，从而产生乙酰辅酶A[14]．相比HWT藻细胞，HDLC藻细胞中酰基辅酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase, ACOX1)和乙酰辅酶A乙酰基转移酶(acyl-CoA acyltransferase, ACAT)的表达量上调． ACOX1参与多种碱基辅酶A的氧化反应，促进脂肪酸的氧化分解[15]；而ACAT催化短链脂肪酸的氧化反应，生成乙酰辅酶A[16]．故而两个基因的上调表达可能一定程度上促进脂肪酸的氧化分解，加快乙酰辅酶A 循环流的流动，进而提高脂肪酸合成的中间产物循环效率．

丙酮酸既是糖酵解途径的终产物，也为糖异生途径的起始反应物．作为乙酰辅酶A的合成前体，丙酮酸与脂质合成代谢有着紧密的联系．在糖酵解及糖异生代谢中，相较于HWT藻细胞，HDLC藻细胞中的葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphcrte isomerases, G6PI)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)及乙酰辅酶A合成酶(acyl-CoA synthetase, ACS)表达水平更高．G6PI催化α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-6-磷酸葡萄糖间的相互转变，及两者向β-D-6-磷酸果糖的转变．β-D-6-磷酸果糖继而在相关酶作用下的产物为磷酸烯醇丙酮酸，接而经PK产生丙酮酸．另一方面，乙醇被氧化为乙醛、醋酸后，经ACS合成乙酰辅酶A．有报道表明，敲除编码G6PI的基因后，鼠细胞中甘油酯含量减少，且油脂代谢中的磷脂酸磷酸酶Ⅰ基因也随之出现表达下调[17]；在莱茵衣藻中过表达ACS2后，导致叶绿体中碳流向乙酰辅酶A合成的方向富集，从而使得三酰甘油含量提高了2.4倍[18]．G6PI、 PK及ACS的表达上调可能通过增加丙酮酸、乙酰辅酶A的含量以增强脂质合成代谢．

在淀粉代谢中，α-D-葡萄糖-1-磷酸为重要的代谢中间物质，磷酸葡萄糖变位酶能将其转化为葡萄糖-6-磷酸，即丙酮酸的前体．相比HWT藻株，HDLC藻株中内切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanohydrolase, EGA)、葡聚糖合酶(glucan synthase, BGS)和果胶酯酶(pectinesterase, PA)均出现表达下调．PA促进ADP-葡萄糖(由α-D-葡萄糖-1-磷酸转化而来)生成直链淀粉；BGS利用α-D-葡萄糖-1-磷酸合成1，3-β-D葡聚糖，继而被转化为D-葡萄糖；EGA则利用以α-D-葡萄糖-1-磷酸为底物合成的纤维素，合成纤维糊精，而后经系列反应产物转变为D-葡萄糖．淀粉代谢途径中3个关键DEGs的下调可能抑制消耗α-D-葡萄糖-1-磷酸的反应过程，间接等导致丙酮酸含量的增加，从而使得碳流定向于脂质合成代谢．