海南三亚黑山羊肠道寄生虫流行病学调查

2021-03-16菅忆晨卢晨阳王占铭李世杰朱建明任瑞雪赵华林司红彬菅复春

中国兽医杂志 2021年12期

菅忆晨，卢晨阳，王占铭，李世杰，朱建明，任瑞雪，赵华林，司红彬，菅复春

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530000 ； 2. 河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046 ；3. 海南志勤畜牧业技术研究院有限责任公司，海南三亚 572000)

海南黑山羊是海南省唯一的地方优良山羊品种，在海南省各市县均有饲养。海南黑山羊具有耐高温高热、耐粗饲、抗病力强、肉用性能好等优点，是中国热带地区规模化养殖宝贵的品种资源[1]。近年来，海南省一直将黑山羊养殖作为海南畜牧业发展的重点之一，黑山羊出栏量也在稳步增长。数据显示，海南省2018年黑山羊出栏量为84.62万只；仅2019年上半年，海南黑山羊出栏量就达到了46.94万只[2]。在巨大的需求面前，海南黑山羊集约化养殖技术的不完善以及经验不足，饲养人员防病意识和技术知识的缺乏等原因导致黑山羊各种疾病的发生[3]，给养殖户造成严重的经济损失。其中肠道寄生虫感染可引起羊腹泻、食欲不振、生长发育不良，严重可导致死亡[4]。目前，尚无海南黑山羊寄生虫流行病学调查的相关报道，为了解海南黑山羊肠道寄生虫感染情况，本试验采集了海南三亚市3个黑山羊养殖场共计100份黑山羊粪便样品进行检测，为有效防控海南黑山羊肠道寄生虫感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 采集样品 2020年9月，在海南省三亚市两家同等规模的集约化羊场(A养殖场和B养殖场)及B养殖场周边散户放牧黑山羊，直肠采集成年黑山羊粪便样品共100份。标记样品信息带回实验室，于4 ℃冰箱保存备检。其中A养殖场的黑山羊采样时，已经近1年未用驱虫药物，黑山羊普遍偏瘦。而B养殖场及其周边散户放牧养殖的黑山羊采样时，近6个月内没有用过驱虫药物。被采样黑山羊均无临床症状。

1.2 样本处理每份粪样分为3份，1份用于显微镜下形态学检查，1份提取DNA，1份分装在2 mL离心管中加2.5%重铬酸钾保存复查。

1.3 试验方法

1.3.1 显微镜检查按参考文献[5]方法对粪样进行水洗离心沉淀、卢戈式碘染色以及饱和蔗糖溶液漂浮后进行显微镜检测。

1.3.2 虫种鉴定根据显微镜检测下观察到的寄生虫卵囊与虫卵的大小、颜色和形状结构等特征按文献[6]对寄生虫进行种类鉴定。并对有球虫感染的样品使用McMaster计数板按照公式计算寄生虫感染强度的参数，即每克粪便中的虫卵数(Eggs per gram, EPG)和每克粪便中的卵囊数(Oocyts per gram, OPG)。

EPG/OPG=(n1+n2)/2÷0.15×60÷2

其中：(n1+n2)/2 为平均每个计数室内的虫卵数/卵囊数，0.15为每个计数室有效体积为0.15 mL，60为粪液总体积为60 mL，2为所用粪便克数为2 g。

1.3.3 DNA的提取参照QMEGA Bio-Tek公司Stool DNA试剂盒说明书提取粪便DNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.4 PCR扩增分别基于核糖体小亚基基因(SSU rDNA)位点分别对毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫、十二指肠贾第虫和隐孢子虫进行PCR扩增。毕氏肠微孢子虫、隐孢子虫、十二指肠贾第虫和芽囊原虫的引物及反应程序按文献[7-9]进行，除使用LATaq酶对十二指肠贾第虫SSU rDNA进行共计2轮的巢式PCR扩增以及使用KOD-plus酶对芽囊原虫进行1轮PCR扩增外，其他原虫均使用KOD plus酶进行巢式PCR扩增。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，KOD-plus酶(日本TOYOBO公司)和LATaq酶(日本TaKaRa公司)，均购自郑州科贸生物技术有限公司。试验中设置阴性和阳性对照。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳、GelRed染色检测，阳性PCR产物由北京诺赛基因有限公司进行双端测序。

1.4 序列分析和统计分析用SeqMan软件对获得的基因序列进行校正，在NCBI网站GenBank中搜索相似序列，用Clustal X 2.11进行比对分析来鉴定隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫种类和十二指肠贾第虫集聚体。使用Excel进行数据统计，同时采用SPSS 18.0 软件进行数据处理，采用Pearson卡方检验计算差异率，P<0.05为具有统计学差异，P<0.01为统计学差异显著，P<0.001为统计学差异极显著。

2 结果

2.1 海南黑山羊肠道原虫感染总情况本次检测的100份样品中，肠道原虫总感染率为83%(83/100)。共检测到5种肠道寄生虫，其中球虫卵囊、线虫虫卵的检出率分别为75%(75/100)和46%(46/100)，未检测到阿米巴原虫。PCR检测到毕氏肠微孢子虫、贾第虫、芽囊原虫共3类寄生虫，阳性率分别为20%(20/100)、11%(11/100)和5%(5/100)，未检测到隐孢子虫。

本试验采样时选择了三亚市两家同等规模的海南黑山羊养殖场及养殖场周边的一些散户放牧黑山羊。其中A养殖场总感染率为98.43%(63/64)，B养殖场总感染率为35.29%(6/17)，B养殖场周边散户放牧羊总感染率为73.68%(14/19)。两家养殖场及散户放牧黑山羊之间肠道寄生虫感染率差异极显著(P<0.001)。

A养殖场的64份粪便样品中检测出5种常见肠道原虫，感染率较高的为球虫89.06%(57/64)和线虫57.81%(37/64)，其次为毕氏肠微孢子虫31.25%(20/64)、芽囊原虫7.81%(5/64)和贾第虫17.18%(11/64)。B养殖场的17份粪便样品中仅检测到球虫1种常见肠道原虫，感染率为35.29%(6/17)。B养殖场周边的散户放牧黑山羊19份粪便样品中显微镜检测出2种寄生虫，分别为球虫63.15%(12/19)和线虫47.36%(9/19)，PCR未检测到其他原虫感染。

2.2 海南黑山羊肠道寄生虫混合感染情况本次检测的100份海南黑山羊粪便样品中共48份为2种及2种以上肠道寄生虫混合感染，混合感染率为48%(48/100)，单种病原感染率为34%(34/100)。A养殖场的粪便样品混合感染率占总混合感染率的85.41%(41/48)。散户放牧黑山羊粪便样品混合感染率占总混合感染率的14.28%(7/49)。A养殖场和散户放牧黑山羊混合感染率差异极显著(P<0.01)。B养殖场无混合感染，仅为单种病原感染，感染率为35.29%(6/17)。

A养殖场黑山羊粪便样品中感染2种寄生虫的样品感染率为31.25%(20/64)，以球虫和线虫的混合感染占比最高，为75%(15/20)。感染3种肠道寄生虫的样品占26.56%(17/64)，主要以球虫、线虫和微孢子虫为主，占64.7%(11/17)。同时感染4种肠道寄生虫的占阳性样品的4.68%(3/64)。5种肠道原虫的混合感染率为1.56%(1/64)。散户放牧黑山羊的混合感染率为36.84%(7/19)，均为球虫和线虫混合感染，占100%(7/7)。

2.3 海南黑山羊不同饲养模式感染情况由表1可知，本次采样时分别采集了圈养(54/100)和放牧(46/100)2种饲养模式，圈养模式总感染率为77.8%(42/54)，放牧模式总感染率为89.1%(41/46)，差异不显著(P>0.05)。

表1 三亚市海南黑山羊肠道寄生虫感染情况Table 1 General situation of intestinal parasite infections in Hainan black goats in Sanya city

其中，A场放牧为主的肠道寄生虫感染率占放牧总感染率的65.85%(27/41)，以放牧为主的散户黑山羊肠道寄生虫感染率占放牧总感染率的34.14%(14/41)。A场圈养模式肠道寄生虫感染率占圈养总感染率的85.71%(36/42)，B场以圈养为主要饲养方式的肠道寄生虫感染率占总感染率的14.28%(6/42)。

A场放牧为饲养模式的肠道寄生虫感染率为100%(27/27)，感染率较高的分别为线虫92.59%(25/27)和球虫85.18%(23/27)，接着为微孢子虫44.44%(12/27)、贾第虫14.81%(4/27)和芽囊原虫7.4%(2/27)。散户放牧黑山羊肠道寄生虫感染率为73.68%(14/19)，主要为球虫85.71%(12/14)和线虫64.28%(9/14)。A场放牧山羊黑山肠道寄生虫感染率与散户放牧黑山羊肠道寄生虫感染率差异显著(P<0.05)。

A场圈养黑山羊肠道寄生虫感染率为97.29%(36/37)，感染率较高的为球虫94.44%(34/36)，其次为线虫33.33%(12/36)、微孢子虫22.22%(8/36)、贾第虫19.44%(7/36)和芽囊原虫8.33%(3/36)。B养殖场圈养黑山羊肠道寄生虫感染率为35.29%(6/17)，仅检测到球虫感染，占100%(6/6)。A场与B场圈养模式下黑山羊肠道寄生虫感染率差异极显著(P<0.001)。

2.4 海南黑山羊肠道寄生虫感染种类及球虫感染强度经显微镜形态学鉴定，本次调查共发现2种线虫卵，分别是毛首线虫和捻转血矛线虫；共5种山羊球虫，分别为艾丽艾美耳球虫(E.alijevi)、苍白艾美耳球虫(E.pallida)、家山羊艾美耳球虫(E.hirci)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)和斑点艾美耳球虫(E.punctata)，其中以艾丽艾美耳球虫(E.alijevi)为优势虫种，占鉴定样品的25%(33/132)。对其中40份球虫阳性样品进行麦克马斯计数，其OPG值介于2 000～5 000的有12份，5 000以上的有7份，其中最高的1份为放牧饲养模式中的阳性样品，OPG值高达17 600。放牧、圈养黑山羊球虫平均OPG值分别为2 012.5和2 450。不同饲养方式下球虫OPG值分布见图1。

图1 不同饲养模式下羊球虫感染强度(OPG)分布情况Fig.1 OPG distribution of Coccidia in different feeding modes灰色正方:圈养饲养模式; 黑色菱形:放牧饲养模式Gray square:Captive feeding mode; Black diamond:Grazing feeding mode

2.5 毕氏肠微孢子虫基因型鉴定共采集100份样品，进行微孢子虫PCR扩增，其中20份样品扩增后出现目的片段，约392 bp(图2)；经双向测序后通过序列对比分析，共检测出2种基因型，分别为BEB6和CHG28。BEB6中2条序列与我国北方马毕氏肠微孢子虫(MN704934)序列的同源性为100%，2条序列与我国西藏绵羊(MK573329)序列同源性为100%。CHG28中16条序列与我国山羊(MN845623)系列同源性为100%。

图2 部分毕氏肠微孢子虫的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of some Entrerocytozoon bieneusi M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：阴性对照；2：阳性对照； 3～7：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

2.6 十二指肠贾第虫基因型鉴定 100份样品中共扩增出11份十二指肠贾第虫的目的片段，约292 bp(图3)；双向测序成功后通过序列对比分析发现仅检测出Assemblage E基因型。其中7条序列与非洲尼日利亚山羊贾第虫(MK487707)序列的同源性为100%，4条序列与我国新疆马贾第虫(MN174123)

图3 部分贾第虫的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of some Giardia duodenum M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：阴性对照；2：阳性对照； 3～7：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

序列的同源性为100%。

2.7 芽囊原虫基因型鉴定仅5份样品扩增出芽囊原虫目的片段，约600 bp(图4)；将芽囊原虫阳性样品测序成功后通过序列对比分析，仅检测出ST10基因型，并且5条序列与马来西亚牛芽囊原虫(MG831498)序列同源性为100%。

图4 芽囊原虫的PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of BlastocystisM:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：阴性对照；2：阳性对照； 3～7：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

3 讨论

本次调查中海南黑山羊肠道寄生虫感染率偏高，混合感染以球虫和线虫感染为主，这可能与采样季节或气候以及饲养模式有关。三亚属于热带海洋性季风气候，年平均气温在25.7 ℃，气候温暖湿润，十分有利于寄生虫病的发生和传播[10]。相关资料表明[11]，四川省部分地区黑山羊春、夏、秋寄生虫感染率明显高于冬季，并且以线虫感染为主。这与本次调查结果相似(线虫感染率占总感染率的55.42%)。因此，海南三亚地区的羊寄生虫病应全年防控。此外，海南黑山羊以放牧饲养为主，一年四季均可在草地、林地和山岭等各种环境放牧。近年来，由于养殖量增加，海南省生态保护政策加强，林地面积扩大，适合黑山羊传统放牧的区域缩小，圈养模式逐渐增加。国内外有关羊肠道寄生虫的调查均发现，放牧模式下线虫感染率明显高于圈养模式[12-13]，而且本试验鉴定出的毛首线虫和捻转血矛线虫均是对热带、亚热带地区畜牧业危害最广泛、造成经济损失最严重的寄生性线虫，常常引起“春潮”导致宿主大批量死亡[14]。这2种消化道线虫也是在牛、羊、骆驼等动物的小肠中较为常见和易于鉴定的虫种[15]。可见放牧羊群更应该注重检测和驱除线虫。

本次调查的A养殖场圈养黑山羊肠道寄生虫感染率高达98.43%，其中球虫感染率为89.06%。在本次调查中共发现了5种山羊球虫，其中艾丽艾美球虫(E.alijevi)、山羊艾美尓球虫(E.caprina)和家山羊艾美耳球虫(E.hirci)均为感染山羊的常见球虫种类，在埃及野生山羊以及巴基斯坦的野生山羊中均有过报道[16-17]。根据球虫的马克马斯特计数可以看出球虫卵囊排出强度差异很大，表明A养殖场黑山羊的球虫感染普遍存在且呈持续感染状态，这可能是该场羊只普遍偏瘦的直接原因，应引起养殖场的关注。A养殖场的感染率表明在高床圈养羊时也不可忽视圈舍卫生管理，及时清理粪便，尤其是羊床漏缝地板之间的粪便污染物，并定期消毒和做好粪便无害化处理。此外，A养殖场的感染率较高的原因与采样羊场近1年内未用驱虫药物也有很大关系。

在PCR检测中发现了毕氏肠微孢子虫、十二指肠贾第虫和芽囊原虫3种肠道原虫，且都是可寄生于人和动物肠道的重要并广泛流行的人兽共患寄生虫，呈世界性分布。在系统发育分析中，微孢子虫的基因型划分为9个组，其中Group 1具有人兽共患性，羊主要感染Group 2中的基因型，其余组群基因型具有宿主特异性[18]。本次调查发现的微孢子虫为Group 2中的2种基因型CHG28和BEB6，其中BEB6亚型宿主范围广，既可感染人，也可感染动物，具有潜在的人兽共患性。在云南乌骨羊[19]和西藏藏绵羊[20]肠道原虫感染情况的报道中，微孢子虫优势亚型均为BEB6，而本调查中CHG28为优势基因型，占毕氏肠微孢子虫阳性样品总数的85%(17/20)。十二指肠贾第虫现已被分为8个不同的聚集体(Assemblage A～H)[21]，其中聚集体A和B是重要的人畜共患亚型，聚集体E则多在偶蹄动物中。芽囊原虫现被分为17个亚型，ST1～9被认为存在人兽共患致病风险，ST10～17只在动物和水中检测到。本次调查海南黑山羊发现十二指肠贾第虫聚集体E基因型以及芽囊原虫ST10基因型。本次检测到的基因型也是在牛、羊和骆驼等动物中最为常见的亚型[22]。上述调查结果表明，肠毕氏微孢子虫亚型分布存在地域或动物品种间的差异，十二指肠贾第虫和芽囊原虫感染亚型相对单一。分析造成海南黑山羊肠道寄生虫感染种类和基因型偏少的原因可能为：首先，海南黑山羊是海南的独特品种，长期以来只在海南岛饲养，与其他省市少有品种交流和异地饲养情况，可能保持其独特的寄生虫感染谱和相对单一的原虫基因亚型特点；其次，饲料、饲草、饲养气候、地理位置等因素也可能是导致海南黑山羊与其他地区羊肠道寄生虫感染种类差异的因素。尚需要加大对海南黑山羊流行病学调查覆盖面和样本数量来证实上述推测。