刘 青 ， 朱云芸 ， 张成林 ， 李 伟 ， 仉 伟 ， 谢绪昌

(1. 济南市公园发展服务中心动物园 ， 山东 济南 250031 ； 2. 北京动物园 ， 北京 西城 100044)

喜马拉雅塔尔羊(Hemitragusjemlahicus)别名塔尔羊，属于牛科，以草本植物为主食，体型健壮善于攀爬，常结群活动，我国于1974年上半年在西藏自治区波曲河谷的曲象地区首次发现[1]。塔尔羊数量稀少、分布狭窄，现已列为国家一级保护动物。济南动物园现有的塔尔羊种群是国内唯一的人工饲养种群。

肠道微生物是指动物肠道内全部的、复杂的、动态变化的微生物群落，正常情况下各类微生物在肠道内保持共生或拮抗关系，共同形成一个动态平衡的微生态系统。与非反刍动物相比，反刍动物的肠道微生物群在物种生物学中扮演着更重要的角色[2]。大多数哺乳动物消化道菌群集中在后肠，主要是结肠，在进行粪便菌群和结肠内容物菌群结构的比较时发现，粪便菌群基本上可以代表肠道内容物菌群[3]，因此对人类和野生动物的研究多以粪便菌群来代表肠道内容物菌群。本试验以塔尔羊粪便作为样本，对同一时期成年和亚成体健康塔尔羊肠道粪便菌群的组成和结构进行分析比较，试验结果可为该种属动物疾病诊断和治疗提供依据。此外，本试验还以塔尔羊粪便中分离出的大肠杆菌作为指示菌，进行种群耐药性监测，掌握群体耐药流行情况，结果为临床治疗用药提供科学参考和指导，从而延缓细菌耐药性的产生和发展。

1 材料与方法

1.1 样品采集 2019年12月份采集济南动物园成年和亚成体健康塔尔羊新鲜粪便样本各6份，放入无菌袋，置于干冰内保存送检。另用无菌棉签采集20份不同个体新鲜粪便放入含500 μL无菌PBS的1.5 mL离心管中，低温保存送回实验室立即处理。

1.2 高通量测序 将粪便样本送至生工生物工程(上海)股份有限公司，提取塔尔羊粪便基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因的V3+V4区域，测序后的数据经拼接、过滤和去嵌合体处理后得到有效数据，在97%的相似度水平下进行OUT聚类和物种分类学统计，并在门、目和属水平上进行细菌组成和丰度对比分析，根据Alpha多样性指数(ACE、Chao、Shannon和Simpson)进行组间差异性分析。

1.3 大肠杆菌的分离鉴定 将含有粪样的PBS加入内含2 mL灭菌营养肉汤的试管中，37 ℃培养扩增，取适宜浓度菌液涂布到大肠杆菌显色培养基中，37 ℃培养18～24 h，挑取蓝绿色菌落进行纯化培养。提取纯化后的细菌DNA，利用细菌16S rRNA基因通用引物(F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 耐药性检测 根据美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，对分离的大肠杆菌进行抗菌药物最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)检测，阳性对照为大肠杆菌ATCC 25922菌株，结果判定参照CLSI标准以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)3种形式记录。

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，使用方差分析法进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著，P≥0.05表示差异不显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 样本序列与OUT聚类 12份样本共获得1 589 702条有效序列，成年组平均122 323条，亚成体组平均142 626条。通过对测序数据按97%的相似水平进行聚类分析，成年组平均每个样本获得4 589个OTU，亚成体组平均获得4 683个OTU。

2.2 粪便菌群组成分析 本试验中检测到的粪便菌共包含18个门、32个纲、41个目、77个科和168个属，见表1。

表1 塔尔羊在不同分类学水平上的菌群组成个数Table 1 The number of flora composition in different taxonomic levels of captive tahr

2.2.1 门分类水平上的细菌组成 在门水平上，厚壁菌和拟杆菌为两大优势菌门。成年组和亚成体组厚壁菌门的平均含量分别为(60.35±1.71)%和(59.96±2.48)%；拟杆菌门的平均含量分别为(29.95±2.80)%和(29.60±2.51)%。丰度大于1%的还有疣微菌门、放线菌门和变形菌门，成年组的含量分别为(3.36±2.80)%、(1.76±0.24)%和(1.30±0.09)%；亚成体组的含量分别为(4.27±1.68)%、(1.69±0.29)%和(1.23±0.31)%。对丰度平均含量前10位的细菌组成进行组间统计学检验，差异不显著(P>0.05)，见图1。

图1 在门水平上的菌群组成Fig.1 Flora composition at the phylum level

2.2.2 目分类水平上的细菌组成 目分类水平上以梭菌目和拟杆菌目为主，其次为疣微菌目、黄杆菌目、Coriobacteriales和丹毒丝菌目。成年组这6种细菌含量分别为(56.69±1.57)%、(25.49±1.69)%、(2.75±0.91)%、(2.16±1.41)%、(1.30±0.19)%和(1.04±0.12)%；亚成体组分别为(56.44±1.95)%、(26.55±3.00)%、(3.75±1.71)%、(1.11±0.82)%、(1.32±0.27)%和(1.11±0.33)%，经组间统计学检验，差异不显著(P>0.05)。

2.2.3 属分类水平上的细菌组成 在属水平上，去除未分类的菌属，成年组排名前5位的菌属分别为拟杆菌属(7.52±0.77)%、孢杆菌属(3.63±1.72)%、梭菌IV(3.32±0.21)%、艾克曼菌属(2.75±0.91)%和普雷沃氏菌属(2.50±0.45)%；亚成体列前5位的菌属分别为拟杆菌属(7.61±1.02)%、艾克曼菌属(3.75±1.71)%、普雷沃氏菌属(3.37±1.41)%、梭菌IV(3.24±0.18)%和颤杆菌克属(2.87±1.53)%。对平均丰度1%的菌属进行组间统计学检验，孢杆菌属含量成年组显著高于亚成体组(P<0.05)，其他菌属含量差异不显著(P>0.05)，见图2。

图2 在属水平上的菌群组成Fig.2 Flora composition at the genus level

2.3 Alpha多样性指数分析 所有样本覆盖率指数大于0.99，表明测序深度已基本覆盖样品中所有物种。成年组的Shannon、Ace、Chao1和Simpson指数均高于亚成体组，统计学检验两组间差异不显著(P>0.05)，菌群多样性和丰度指数见表2。

表2 塔尔羊粪便菌群Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity index of fecal microflora in captive tahr

2.4 大肠杆菌耐药性 从20份粪便样本中各分离出1株大肠杆菌，共20株。通过微量肉汤法检测药物敏感性，结果显示，大肠杆菌分离株对磺胺类和四环素类耐药率均为5%，总体耐药率为10%；对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多黏菌素类和酰胺醇类药物全部敏感，见表3。

表3 大肠杆菌耐药表型Table 3 Escherichia coli drug resistance profile (%)

3 讨论

本试验利用Illumina MiSeq高通量测序方法对12份塔尔羊粪便样本进行分析，共鉴定出18个门、32个纲、41个目、76个科、168个属。通过稀释曲线、Rank abundance曲线和Alpha多样性指数进行样本的复杂度分析，测序深度已基本覆盖所有细菌。试验结果可见塔尔羊粪便菌群优势菌门为厚壁菌和拟杆菌门，这也是典型的反刍动物肠道微生物，与赵贵军等[4]对林麝粪便菌群的研究和靳长青等[5]对滩羊肠道菌群的研究结果相同。厚壁菌在降解粗纤维的消化过程中发挥重要的作用[6]，拟杆菌主要功能是降解寡糖[7]，本试验中成年组和亚成体组中优势菌门总含量分别为90.50%和89.56%。从门、目水平对成年组和亚成体组菌群组成丰度进行对比分析，差异均不显著(P>0.05)。在属水平上，成年组孢杆菌属含量显著高于亚成体(P<0.05)，其他菌属差异不显著(P>0.05)。本试验中亚成体组塔尔羊年龄在1.5～4.0岁，成年组在5～10岁，两组动物在饲料供给和摄取上基本相同，可见在相同圈养环境条件下食物结构可能对动物群体肠道菌群的分布起到重要的作用。

细菌耐药问题日益严重，肠杆菌科细菌作为肠道内的常见阴性菌，是开展耐药细菌流行病学调查和研究的重要指示菌。反刍动物口服抗生素会对瘤胃微生物群落的发育、繁殖有强烈的抑制作用，可导致菌群失衡，因此抗菌药物的使用量比其他种类动物要少，但也有报道显示从不同反刍动物中分离的大肠杆菌存在较高的耐药性：王显峰等[8]分离的羊源大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林等9种药物耐药率在53.3%以上；卢婷[9]分离的牛源大肠杆菌对22种抗菌药物均产生不同程度的耐药性，其中有7种抗菌药物的耐药率超过50%；陆晓健等[10]从草食野生动物粪便中分离的大肠杆菌对复方新诺明的耐药性为57.64%。本试验通过细菌培养的方式分离塔尔羊粪便中的大肠杆菌，对其耐药性进行检测，结果显示，塔尔羊种群粪便大肠杆菌对磺胺甲噁唑和四环素的耐药率均为5%，对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多黏菌素类、酰胺醇类药物均敏感，总体耐药率为10%，低于陈家露等[11]和刘晨阳[12]对羊源大肠杆菌耐药性的检测结果，相同的是磺胺类和四环素类药物耐药性高于其他类抗生素。磺胺类抗菌药通过干扰细菌内叶酸合成发挥抑菌作用，细菌主要通过产生低亲和力的二氢叶酸合成酶以获得耐药性。四环素类药物是与细菌的核糖体结合，干扰细菌蛋白质的翻译达到抑菌目的，其外排泵蛋白和降解酶的出现使得细菌对四环素类抗菌药产生耐药性[13]。这两大类药物都是广谱抗菌药，在兽医临床上发挥重要作用，野生动物抗感染治疗一般为个体给药，也没有作为促生长剂添加使用，这是耐药性相对较低的主要原因，但磺胺和四环素类药物耐药基因都主要位于质粒上[14-16]，因此要注意防止质粒传播造成的耐药性扩散。

本试验获得的成年和亚成体健康塔尔羊粪便菌群结构，为塔尔羊人工饲养提供数据，未来会针对性的研究肠道菌群变化与疾病之间潜在的关系，为种群的疾病监测和治疗提供新思路。对塔尔羊种群大肠杆菌耐药性的研究提示该种群应注意抗菌药物的选择与合理使用，近期应谨慎使用磺胺类和四环素类药物的使用，并注重耐药性的长期监测，防止耐药范围的进一步扩大。