冷 梅 ， 唐 爽 ， 练家敏 ， 邵冠明 ， 谢青梅 ， 蔺文成

(华南农业大学动物科学学院 ， 广东 广州 510000)

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronavrindac)γ冠状病毒属(Coronavirus)[1]，是一种单股正链RNA病毒。IBV基因组易发生重组、变异，导致新的变异株不断产生，给该病的防控带来了巨大的挑战。S1基因是IBV的基因分型依据，其编码的S1蛋白是IBV的主要免疫原蛋白，能够诱导机体产生中和抗体[2-7]，因此通过比较分析毒株的S1基因序列，就可以了解IBV基因型的流行趋势以及毒株的变异情况，为鸡传染性支气管炎(IB)的防控以及研制新型疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料和鸡胚 从江苏省常州、盐城、连云港3个地区的鸡场采集疑似感染鸡传染性支气管炎病料23份，主要为气管、肺脏、肾脏、输卵管、肝脏等组织。试验用SPF鸡胚(9～11日胚龄)，购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

1.2 主要试剂 核酸抽提试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒和pMD19-T Vector Cloning Kit，均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞和DNA聚合酶LATaq，均购自Tiangen生物公司。

1.3 毒株的分离鉴定

1.3.1 病毒分离 (1)病料的处理：将病料剪碎、研磨成匀浆后，按1∶5比例加入灭菌PBS缓冲液制成悬液，反复冻融3次，10 000 r/min离心5～10 min，取上清液用滤器过滤除菌后备用。(2)鸡胚接种：滤液按0.2 mL/枚经尿囊腔各接种3枚9～11日龄的鸡胚(同时PBS接种2枚作为对照)，置37 ℃孵育，每天照胚3次，弃去24 h内死亡的鸡胚，继续孵育至48 h。将鸡胚置于4 ℃冰箱过夜或者-20 ℃、30 min后无菌抽取尿囊腔液，并将同一病料接种后收获的尿囊液混合，继续盲传3代，收集并分装F3代尿囊液然后放置-80 ℃保存备用。

1.3.2 病毒鉴定 (1)血凝试验(HA)：在96孔“V”型板微孔板上每孔滴加PBS缓冲液50 μL，加入50 μL待测抗原(尿囊液)于第1列孔中，反复吹打几次混匀后吸50 μL至第2孔，依次倍比稀释至倒数第2列，最后1列不加抗原作为对照；再加入0.1%鸡红细胞悬液50 μL/孔，置微型混合器上震荡30 s或以手持血凝板绕圆圈混匀；置37 ℃恒温箱中10～15 min。将反应板竖立起来，若红细胞呈泪滴状流动者为沉淀，表明为凝集；若红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表示红细胞被病毒凝集。完全凝集的抗原最高稀释倍数即为HA效价。(2)鸡胚发育受阻试验：盲传3～5代后HA阴性的尿囊液接种9 ～11日龄的SPF鸡胚的尿囊腔，每份样品接种两组：一组孵化48 h后收集尿囊液；另一组继续孵化至17～19日龄，观察胚体发育情况。鸡胚发育受阻判断标准：鸡胚发育迟缓，表现出蜷曲胚，趾爪变形并紧抱头部，羊膜增厚紧贴鸡胚，尿囊液中有白色的尿酸盐结晶，肾小管、输尿管有白色尿酸盐沉积。(3)RT-PCR鉴定：根据核酸提取试剂盒说明书的方法提取尿囊液的病毒核酸，通过RT-PCR鉴定，扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共32个循环；72 ℃终延伸5 min。产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察并记录结果。

1.4 基因克隆与测序 根据GenBank已发表的S1基因序列设计PCR引物，引物序列参考文献[5]设计：S1-F:5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′；S1-R:5′-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′。引物由北京华大基因科技有限公司合成。将23株IBV分离株的S1基因通过RT-PCR进行扩增，将RT-PCR产物回收纯化以后，连接到pMD19-T载体上，再转化感受态DH5α细胞，在含Amp抗性LB平板上培养12 h后，挑取单个菌落进行PCR鉴定，阳性样品委托北京华大基因科技有限公司测序。

1.5 IBV分离株S1基因的进化分析 用DNASTAR和MEGA 5.2生物学软件对23株IBV分离株的S1基因序列及推导氨基酸序列进行分析。IBV参考毒株及其GenBank登录号如下：DY05(GQ265928)、YX10(JX840411)、A2(AY043312)、QXIBV(AF194323)、LX4(AY338732)、SAIBK(DQ288927)、HN08(GQ265940)、TA03(AY837465)、D90(MF508703.1)、QXL87(MH743141)和7/93(Z83979)。

1.6 IBV分离毒株的重组分析 利用重组检测程序4(RDP v.4.97)软件对IBV分离株S1基因进行假定重组分析。共采用RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、PhyLPro、LARD和3Seq共9种方法分析假定的重组事件。重组事件只要有5种方法支持且P值调整到0.05，那么可以认为结果为阳性。通过SimPlot软件(3.5.1版)进一步验证了潜在的重组事件。

2 结果

2.1 IBV分离株S1基因的遗传进化分析 23个IBV分离株S1基因核苷酸序列已上传至 GenBank，所获得注册序列号见表1。通过对23个IBV分离毒株与11个参考株的S1基因进化分析发现，23个分离毒株中有16个QX型分离株和7个HN08型分离株。QX型分离毒株又分为Cluster Ⅰ亚分支(8个，50.0%)、Cluster Ⅱ亚分支(6个，37.5%)和Cluster Ⅲ亚分支(2个，12.5%)。见图1。

表1 2019年江苏地区IBV分离毒株及S1基因信息Table 1 Details of IBV isolates and S1 gene from Jiangsu province in 2019

图1 江苏地区IBV分离株与参考株S1基因系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of S1 gene of IBV isolates and reference strains from Jiangsu province●:分离毒株； ○:重组分离毒株●:Isolated strains; ○:Isolated strains of recombination

2.2 IBV分离株S1基因同源性分析 由表1可知，23个IBV分离株S1基因核苷酸序列长度介于1 610～1 641 bp,分别编码536～547个氨基酸，说明分离毒株的碱基存在一定插入和缺失。23个IBV分离毒株与11个IBV参考株S1基因核苷酸序列一致性为77.0%～99.9%，氨基酸一致性为66.2%～99.8%，分离毒株与参考株间的一致性差异大。23个IBV分离毒株之间S1基因核苷酸序列一致性为82.9%～99.9%，氨基酸一致性为79.2%～99.7%。QX型为IBV主要流行基因型，此型3个亚分支分离毒株间S1基因核苷酸序列一致性为96.0%～99.8%，氨基酸序列一致性94.3%～99.6%。Cluster Ⅰ亚分支分离毒株间S1基因核苷酸序列一致性为97.9%～99.8%，氨基酸一致性为96.5%～99.6%。Cluster Ⅱ亚分支分离毒株间S1基因核苷酸序列一致性为97.2%～99.6%，氨基酸一致性为96.3%～99.3%。Cluster Ⅲ亚分支分离毒株间S1基因核苷酸序列一致性为99.8%，氨基酸一致性为99.6%。Cluster Ⅰ亚分支分离毒株和Cluster Ⅱ亚分支分离毒株的S1基因核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性差异度比Cluster Ⅲ分离株大，经比对Cluster Ⅰ亚分支分离毒株和Cluster Ⅱ亚分支分离毒株的S1基因核苷酸序列，发现它们的核苷酸发生了部分位点的增添和缺失以及个别位点的突变。HN08型分离毒株间S1基因核苷酸序列一致性为99.0%～99.8%，氨基酸一致性为98.4%～99.6%，同源性较高。

2.3 变异株的重组分析 通过对连云港市IBV分离株CKCHJSLYG1912-5的S1基因重组分析发现，假定亲本HN08型SAIBK毒株与QX型QXL87毒株S1基因发生基因重组，重组片段长度为120 bp，见表2。

表2 变异株CKCHJSLYG1912-5的S1基因重组事件信息Table 2 S1 gene recombination events in CKCHJSLYG1912-5

3 讨论

江苏省是我国重要的养禽大省，而其中连云港、常州、盐城3个地区的存栏量较多。本试验通过对2019年冬季江苏地区23份临床样品进行病毒分离鉴定，检测到23份IBV阳性样品。分离毒株与参考株间的一致性差异大，猜测S1基因的多样性差异可能是目前导致免疫失败的一个重要原因。2011—2019年本实验室对江苏地区IBV分离株鉴定发现，QX型占57%，为主要流行基因型，这与国内QX型流行情况一致[8]，TW Ⅰ型占17%、4/91型占3%、Mass型占13%、CH Ⅲ型占10%[9]。本试验分离的IBV毒株中，QX型仍为主流基因型，值得注意的是，HN08型IBV分离株所占比例较大，揭示了江苏地区IBV优势基因型，为该地区的IB防控提供参考。临床上依然是以肾型IBV为主，少量呼吸型IBV，发病季节也多为寒冷潮湿的11月份和12月份，因为冬季的过度保暖导致鸡舍通风不良，空气质量差，这些都是IB爆发的主要诱因。本试验对江苏省3个地区(连云港、盐城、常州)IBV分离毒株的S1核苷酸序列进行遗传进化分析，发现23株分离毒株与11株参考毒株之间的同源性差异较大，说明江苏地区IBV分离毒株的S1基因在不断发生进化，而且出现了亚分支，这将会给该地区IB的防控带来新的难题。不同地区毒株向着不同的基因型进化，呈现出一定的地域性，该现象与其他学者研究结果相似[10]。在本试验的分离毒株中QX型是主流基因型(70.0%)，QX型的亚分支Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ以及Cluster Ⅲ分离毒株分布比较集中，说明同亚分支毒株间亲缘性强。相同基因型的分离毒株间一致性较高，说明该地区相同基因型的毒株同源性强。对各个基因型分离毒株裂解位点进行分类统计，QX型分离毒株裂解位点有HRRRR(12株)和HRHRR(4株)；HN08型分离毒株裂解位点全部为HRRRR(7株)；表明裂解位点与基因型没有必然联系。

对CKCHJSLYG1912-5毒株的S1基因重组分析发现，HN08型SAIBK毒株与QX型QXL87疫苗株S1基因发生了重组，揭示了连云港地区减毒活疫苗的使用是IBV发生重组的关键因素，由于发生重组片段仅有120 bp，所以该毒株没有单独形成进化分支。目前减毒活疫苗仍是防控IB的主要手段[11-12]，其优点是能诱导机体高效的免疫应答，但在免疫鸡群中持续存在，成为IBV重组的供体。长期的流行病学监测可为该地区疫苗选择提供依据，降低IBV重组的概率。