冷 梅 ， 唐 爽 ， 练家敏 ， 邵冠明 ， 谢青梅 ， 蔺文成

(华南农业大学动物科学学院 ， 广东 广州 510000)

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronavrindac)γ冠状病毒属(Coronavirus)[1]，是一种单股正链RNA病毒。IBV基因组易发生重组、变异，导致新的变异株不断产生，给该病的防控带来了巨大的挑战。S1基因是IBV的基因分型依据，其编码的S1蛋白是IBV的主要免疫原蛋白，能够诱导机体产生中和抗体[2-7]，因此通过比较分析毒株的S1基因序列，就可以了解IBV基因型的流行趋势以及毒株的变异情况，为鸡传染性支气管炎(IB)的防控以及研制新型疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料和鸡胚 从江苏省常州、盐城、连云港3个地区的鸡场采集疑似感染鸡传染性支气管炎病料23份，主要为气管、肺脏、肾脏、输卵管、肝脏等组织。试验用SPF鸡胚(9～11日胚龄)，购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

1.2 主要试剂 核酸抽提试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒和pMD19-T Vector Cloning Kit，均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞和DNA聚合酶LATaq，均购自Tiangen生物公司。

1.3 毒株的分离鉴定

1.3.1 病毒分离 (1)病料的处理：将病料剪碎、研磨成匀浆后，按1∶5比例加入灭菌PBS缓冲液制成悬液，反复冻融3次，10 000 r/min离心5～10 min，取上清液用滤器过滤除菌后备用。(2)鸡胚接种：滤液按0.2 mL/枚经尿囊腔各接种3枚9～11日龄的鸡胚(同时PBS接种2枚作为对照)，置37 ℃孵育，每天照胚3次，弃去24 h内死亡的鸡胚，继续孵育至48 h。将鸡胚置于4 ℃冰箱过夜或者-20 ℃、30 min后无菌抽取尿囊腔液，并将同一病料接种后收获的尿囊液混合，继续盲传3代，收集并分装F3代尿囊液然后放置-80 ℃保存备用。……