万美铄 ， 罗冬柳 ， 杨乃喜 ， 沈旭东 ， 杨桂君 ， 葛 铭 ， 张瑞莉

(1.东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030 ； 2. 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

中草药具有抗菌、消炎、增强机体免疫等功能，且有不易产生细菌耐药性、低毒、无残留或低残留等优点[1]，在防治畜禽腹泻性疾病上有独特的优势。泰山磐石散出自明代徐春甫所著《古今医统大全》，由党参、熟地黄、白术、黄芪、当归、黄芩、川芎、白芍、续断、砂仁和炙甘草组成，几味药共同作用可以补气健脾，防止气机阻滞，起到顺气安胃的功效，在维持妊娠、抗氧化应激、提高免疫功能方面起到一定的作用[2]。目前，泰山磐石散抗仔鼠腹泻的主要机制还未见报道，畜禽疾病的防控强调预防重于治疗，因此本试验采取“仔病母治”的方法，分别在产前和产后饲喂母鼠中药泰山磐石散，针对所产仔鼠建立腹泻模型，通过检测仔鼠腹泻指数、小肠消化酶的活性以及肠道TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达量，探究泰山磐石散防治仔鼠腹泻的作用机制，从而为泰山磐石散在临床的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 泰山磐石散组方：党参、白术、黄芪、当归、黄芩、白芍、续断各30 g，川芎15 g，砂仁15 g，炙甘草12 g，熟地黄45 g，均购自哈尔滨市实英药材有限公司。番泻叶，购自哈尔滨市实英药材有限公司。大肠埃希菌由本实验室从腹泻仔猪粪便中分离获得。昆明小鼠，购自哈尔滨市双城区新兴镇见林养殖场。

1.2 中药复方及致泻剂的制备

1.2.1 泰山磐石散的制备 首先将洗净杂质的药材放入装有300 mL蒸馏水的煎药壶中，浸泡30 min，用武火煎煮沸腾，再用文火煎煮约40 min后将砂仁倒入，继续煎煮3～5 min，然后将熬好的药液倒入干净的烧杯中，经3层医用纱布过滤药渣，最终将药液浓度调至1 g/mL(即每1 mL含原生中药1 g)，4 ℃保存备用。

1.2.2 番泻叶煎剂的制备 将番泻叶加入装有蒸馏水的煎药壶中煎煮10 min，再将经3层纱布过滤后的药液浓缩成0.3 g/mL的煎剂，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 大肠埃希菌菌液的制备 大肠埃希菌由实验室从腹泻仔猪粪便中分离，接种于普通肉汤培养基中，置于37 ℃温箱中培养24 h，配置浓度为1×109个/mL菌液，4 ℃保存备用。

1.3 动物分组及处理 将28只妊娠13 d的母鼠，随机分为空白对照组(C组)、腹泻模型组(Ⅰ组)、产前饲喂中药组(Ⅱ组)和产后饲喂中药组(Ⅲ组)，每组7只。Ⅱ组母鼠灌胃泰山磐石散煎剂，0.15 mg/只，连续5 d；Ⅲ组母鼠在其产后第5天起，对母鼠灌胃泰山磐石散煎剂，0.15 mg/只，连续5 d；C组和Ⅰ组母鼠每天灌胃生理盐水，0.15 mL/只。自仔鼠出生第13天起，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组仔鼠灌服番泻叶煎剂，0.15 mg/只，并腹腔注射大肠埃希菌菌液，0.15 mL/只；给C组仔鼠灌服生理盐水，0.3 mL/只。将仔鼠分别放在鼠笼内，鼠笼内垫好滤纸，并且每隔1 h更换1次，连续6 d。灌胃后0～6 h，持续观察用药反应并记录仔鼠腹泻情况。

1.4 仔鼠腹泻情况测定 给药后，记录并计算小鼠0～6 h内的稀便率、稀便级和腹泻指数[3]。稀便率为每只小鼠所排稀便数与总便数的比值；稀便级按照粪便污染滤纸的污迹面积分为4级(表1)；腹泻指数=稀便率×稀便级。

表1 小鼠粪便分级Table 1 Fecal grading of mice

1.5 样品采集及保存 在仔鼠第19日龄时，禁食不禁水12 h，分别从各个组别的各窝仔鼠中随机抽取3只仔鼠，麻醉、称量各自体重后采用颈部脱臼法处死仔鼠，采取仔鼠的十二指肠、空肠及回肠，于-80 ℃低温冰箱中保存。

1.6 仔鼠小肠酶活性检测 将保存的十二指肠、空肠及回肠清空内容物后做研磨处理，3 000 r/min离心10 min，取上清液，利用ELISA试剂盒检测淀粉酶、蔗糖酶、乳糖酶、麦芽糖酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性。以上试剂盒均购自泉州科诺迪生物技术有限公司，检测步骤参照试剂盒说明书进行。

1.7 仔鼠肠道TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达检测 取100 mg保存的空肠组织，加入100 mL含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE后转膜。在室温下用5%脱脂乳封闭膜2 h，在4 ℃下分别使用兔抗TLR4(1∶1 000)、兔抗NFκB-p65(1∶1 000)、兔抗MyD88(1∶1 000)、兔抗IκBα(1∶1 000)、兔抗COX-2(1∶1 000)及β-action(1∶10 000)抗体孵育过夜，洗膜，10 min/次，连续3次，用HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000)(以上抗体均购自沈阳万类生物科技有限公司)在37 ℃下孵育1 h，洗膜后用ECL进行显色(上海天能科技有限公司)。应用Image J软件对Western Blot条带进行半定量分析。

1.8 数据分析 各组试验数据通过Microsoft Excel处理后，使用SPSS Statistics 23.0软件对结果进行单因素方差分析和t检验进行统计学比较，采用GraphPad Prism 8.0进行绘图，以P<0.05为差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 泰山磐石散对仔鼠腹泻情况的影响 由表2可知，在造模后6 h内，C组仔鼠腹泻指数一直为0，Ⅰ组较C组显著升高(P<0.05)；且Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的仔鼠腹泻指数均表现出先升高后降低的趋势；在造模后2～3 h内，3个组均出现最大腹泻指数。在造模后6 h内，Ⅱ组和Ⅲ组仔鼠的腹泻指数均较I组显著降低(P<0.05)，其中，造模后0～1 h、2～5 h内，Ⅲ组仔鼠的腹泻指数显著高于Ⅱ组(P<0.05)；在造模后1～2 h、5～6 h内，Ⅱ组和Ⅲ组仔鼠的腹泻指数无显著差异(P>0.05)。

表2 仔鼠给药后0～6 h内的腹泻指数Table 2 Diarrhea index of offspring mice within 0-6 h after administration

2.2 泰山磐石散对仔鼠小肠常规消化酶活性的影响 由图1可知，Ⅰ组与C组相比，仔鼠十二指肠和空肠中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性显著降低(P<0.05)，回肠中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性显著降低(P<0.05)；Ⅱ组与Ⅰ组相比，仔鼠十二指肠和空肠中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，回肠中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性显著提高(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅰ组相比，仔鼠十二指肠中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，空肠中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，回肠中淀粉酶和脂肪酶活性显著提高(P<0.05)；Ⅱ组和Ⅲ组仔鼠小肠各消化酶活性无显著性差异(P>0.05)。

图1 仔鼠小肠中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性变化Fig.1 Changes of amylase,lipase,trypsin and chymotrypsin activities in the small intestine of offspringA:糜蛋白酶； B:胰蛋白酶； C:淀粉酶； D:脂肪酶A：Chymotrypsin; B：Trypsin; C：Amylase; D：LipaseⅠ组与C组比较，#：P<0.05; Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较，*：P<0.05; Ⅲ组与Ⅱ组比较，+：P<0.05； 下图同Comparison between group Ⅰ and group C,#:P<0.05; Comparison between group Ⅱ，group Ⅲ and group Ⅰ,*：P<0.05; Comparison between group Ⅲ and group Ⅱ,+：P<0.05. The same as below

2.3 泰山磐石散对仔鼠小肠二糖酶活性的影响 由图2可知，Ⅰ组与C组相比，仔鼠十二指肠、空肠及回肠中乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性显著降低(P<0.05)；Ⅱ组与Ⅰ组相比，仔鼠十二指肠中乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性显著提高(P<0.05)，空肠中乳糖酶和麦芽糖酶活性显著提高(P<0.05)，回肠中乳糖酶和蔗糖酶活性显著提高(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅰ组相比，仔鼠十二指肠和回肠中乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性显著提高(P<0.05)，空肠中乳糖酶和麦芽糖酶活性显著提高(P<0.05)；Ⅱ组和Ⅲ组仔鼠小肠各消化酶活性无显著性差异(P>0.05)。

图2 仔鼠小肠中乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性变化Fig.2 Changes of lactase,sucrase and maltase activities in the small intestine of offspringA：乳糖酶； B：蔗糖酶； C：麦芽糖酶A：Lactase; B：Sucrase; C：Maltase

2.4 泰山磐石散对仔鼠肠道TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 由图3可知，Ⅰ组与C组相比，仔鼠肠道中TLR4、NF-κB-p65、MyD88、IκBα、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.05)；Ⅱ组与Ⅰ组相比，仔鼠肠道中TLR4、NF-κB-p65、MyD88、IκBα、COX-2蛋白表达量均显著降低(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅰ组相比，仔鼠肠道中IκBα、COX-2蛋白表达量均显著降低(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅱ组相比，仔鼠肠道中TLR4、NF-κB-p65、MyD88、IκBα、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。

图3 仔鼠小肠TLR4/NF-κB通路蛋白相对表达量Fig.3 Relative expression of TLR4/NF-κB pathway protein in small intestine of offspringA:Western Blot; B:TLR4； C:NF-κB-p65； D：MyD88； E：IκBα； F：COX-2

3 讨论

妊娠期母体的营养调控对后代的生长发育、免疫性能和组织器官发育均具有重要作用[4]。仔畜生长除了受到遗传和外界环境影响，还受到胚胎期在母体内的发育状况和产后母体泌乳性能的影响，初乳是仔畜获取营养与被动免疫的主要来源，若母体泌乳性能不足则会导致仔畜免疫力降低，引发腹泻。妊娠期母体的营养调控则直接影响了胚胎发育和母体产后泌乳力，因此，增强母体的营养水平对提高仔畜抗病力及生长性能有重要作用。多项研究表明，在妊娠期间饲喂母畜复方中草药可以提高母畜的繁殖性能和仔畜的生长性能，预防仔畜腹泻的发生[5-7]，提示在母畜妊娠期间加饲中草药不仅可以给母畜补充营养物质，还能增强胎儿的生长发育，产后通过母乳喂养，进一步增强了仔畜的抵抗力，对预防仔畜腹泻有着积极的影响。因此，本试验分别在产前和产后饲喂母鼠泰山磐石散，对泰山磐石散抗仔鼠腹泻的作用进行了研究。

腹泻指数评分被用作判断畜禽腹泻水平的通用标准，并且，模型组与对照组相比，当腹泻率与腹泻指数有显著差异时，被认为造模成功[3]。本试验结果显示，模型组仔鼠腹泻指数较空白对照组显著升高，产前及产后组仔鼠腹泻指数较模型组显著降低，这与王月等[8]研究结果一致，说明本试验利用番泻叶和大肠杆菌所致的小鼠腹泻模型制备成功，且饲喂母鼠泰山磐石散后，能显著降低仔鼠的腹泻情况；产前组在造模后0～1 h、2～5 h内的仔鼠腹泻指数显著低于产后组，说明在母鼠妊娠期间给药降低仔鼠腹泻的效果要优于产后给药。

消化酶是畜禽体内消化腺和消化系统分泌的具有催化各种生化反应的一类酶，具有高度的催化性和专一性，能将畜禽摄入体内的营养物质进行消化和分解[9]。肠道中酶活性变化与机体的消化吸收功能息息相关[10]。Liu等[11]研究发现，在母猪妊娠期间饲喂高能饲料，与对照组相比，显著提高了后代新生仔猪肠道中乳糖酶和蔗糖酶活性。本试验结果显示，模型组仔鼠各肠段消化酶活性较空白组显著降低，产前及产后组仔鼠各肠段消化酶活性均较模型组显著升高。这说明泰山磐石散灌胃母鼠后，能增强仔鼠肠道消化酶活性，进而提高仔鼠肠道对蛋白质、糖类等营养物质的消化吸收功能。

TLR4/NF-κB信号通路蛋白在细胞免疫应答、炎症反应等过程中起着关键性作用。Toll样受体(Toll like receptor，TLR)作为跨膜受体，积极参与黏膜先天免疫，TLR4作为脂多糖(LPS)的模式识别受体，会激活下游核因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)信号通路，最终引起炎症反应[12]。MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IκBα(Inhibitor of NF-κB-α，IκBα)是NF-κB信号通路中的下游因子，能够激活炎症通路，促进炎症介质的大量表达，环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在细胞受到炎症刺激时大量产生，可以快速应答一系列促炎介质和细胞因子。大量研究表明，中药能够通过抑制LPS/TLR4/NF-κB通路中的炎症因子(TNF-α、IL-6、NF-κB等)，从而缓解炎症状态[13]。中药复方理中汤可以通过对TLR-2/MyD88信号通路的抑制起到对胃的保护作用[14]，泰山磐石散可以调节妊娠小鼠体内相关免疫细胞及细胞因子的平衡状态，发挥免疫防护作用[15]，党参也可以抑制TLR4/NF-κB通路活化，抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的生成与释放[16]。本试验结果显示，与模型组相比，产前组TLR4、NF-κB-p65、MyD88、IκBα、COX-2蛋白表达水平显著下降，产后组IκBα、COX-2蛋白表达水平显著下降，这与上述研究结果一致，而TLR4显著升高的原因可能是造模时腹腔注射大肠杆菌过量引起。同时，产前组的TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达量与产后组相比显著下降，表明饲喂母鼠泰山磐石散后，抑制了仔鼠NF-κB信号通路炎症关键因子蛋白表达，对腹泻引发的肠道炎症有显著的改善作用，并且在母鼠妊娠期间给药对炎症因子蛋白表达的抑制效果要优于产后给药。

4 结论

给妊娠母鼠饲喂泰山磐石散增强了仔鼠肠道消化吸收功能，并通过抑制TLR4/NF-κB信号通路相关炎症因子蛋白表达，减轻了仔鼠腹泻的发生。