王守法，赵淑琴，刘彩萍，张彩霞，韩 乐，祝莉萍，汪瑞龙

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学基础实验教学中心，甘肃兰州 730070）

已有研究表明，Cry1 蛋白在人和小鼠的垂体、肝脏、性腺等组织中广泛表达[8]。罗万伟等[9]研究发现，Cry基因在不同年龄段的绵羊垂体中均有表达。Cry1 蛋白在30 日龄牦牛睾丸中的表达量最低，随着年龄的增长表达量逐渐增高[10-11]。研究哺乳动物生物钟节律基因的表达对分析动物的季节性发情意义重大。但目前对Cry1 蛋白在绵羊生殖轴系中表达定位的报道较少。本实验对发情期绵羊生殖轴系中Cry1 蛋白的表达进行了研究，对Cry 蛋白进行生物信息学分析，为分析动物繁殖与生物钟之间的联系提供了重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 样品采自于甘肃省兰州市小西湖屠宰场，选健康成年雄性绵羊6 头，颈部放血致死，采集松果体、下丘脑、垂体、睾丸和附睾组织，将这些组织分成2 份，一份置于液氮中保存，另一份置于10% 的福尔马林中保存。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 免疫组化实验所用到的抗体：一抗rabbit anti-CRY1，二抗Affinipure goat anti-rabbit IgG、rabbit anti-β-actin、免疫组化试剂盒均购自北京博奥森生物公司；RNA 提取试剂盒、蛋白Marker、cDNA 反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；高效RIPA 裂解液（组织/细胞）、Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝公司。

1.2.2 仪器 AO-820 组织切片机（Reichert，美国）；HI1210 摊片机（徕卡，上海）；实时荧光定量PCR 仪LightCycler96（Roche，瑞士）；微型垂直电泳槽、电转印槽（伯乐公司，美国）；DP71 显微镜（Olympus，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 Quantitative RT-PCR 反应 各组织中RNA 的提取严格按照RNA 提取试剂盒说明书进行操作，并用超微量核酸蛋白测定仪测定RNA 浓度，用0.1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。……