王智华，李小娟，曹 倩，马小磊，高庆波

(1 中国科学院 西北高原生物研究所，高原生物适应与进化重点实验室，西宁 810001；2 中国科学院大学，北京 100049；3 青海民族大学 生态环境与资源学院，西宁 810007；4 中国科学院 西北高原生物研究所，青海省作物分子育种重点实验室，西宁 810001)

特有物种的形成及其居群的不连续分布通常与生境的片段化密切相关[1-3]，并受到随后气候波动和环境变化的影响[3]。狭域分布的特有物种一般具有特殊的生态需求，竞争能力和扩散能力相对较弱，形成居群个体数较少且相互隔离的分布格局[4-6]。狭域分布特有物种的居群由于受到瓶颈效应、遗传漂变、近交衰退等因素的影响，常常具有较低的遗传多样性[3-4]，更易受到环境波动和人类活动的影响，成为保护生物学关注的热点。

虎耳草属(SaxifragaL.)是虎耳草科(Saxifragaceae)最大的属，全世界约500种，主要分布在北半球的高山地区和环北极地区[7]。中国分布有虎耳草属植物约216种，其中约60%为中国特有种，主要为青藏高原-喜马拉雅地区狭域分布种[8]。目前，关于中国虎耳草属植物的研究主要集中在分类学[9-13]、系统发育学[14-15]、物种分化[16-18]及广布物种的谱系地理学方面[7,19-20]。在青藏高原-喜马拉雅地区狭域分布的特有虎耳草属植物遗传多样性研究鲜有报道。

黑虎耳草(SaxifragaatrataEngl.)隶属于虎耳草属小花组(sect.Micranthes)[8]。分子系统发育学研究发现，小花组与虎耳草属其他物种亲缘关系较远，而与虎耳草科其他属亲缘关系较近，建议将小花组从虎耳草属分离出来，成立独立的属MicranthesHaworth[21-22]。由于缺乏可接受的中文名，本研究仍将黑虎耳草作为广义虎耳草属的物种来处理，并采用原有的拉丁名和中文名。黑虎耳草为多年生草本植物，叶基生，花多数，组成圆锥状或总状花序[23]。该物种生于海拔3 000～4 200 m的高寒草甸或流石滩，为祁连山地区特有狭域分布种[23]。此外，黑虎耳草为传统藏药，以花入药，微苦，寒；退热，治肺部疾病[23]。根据野外调查发现，该物种分布范围狭窄，居群间相互隔离，居群内个体数少，易受到生境变化及人类活动的影响。

本研究选取叶绿体DNA(cpDNA)rbcL、trnS-G片段和核糖体DNA(nrDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)对祁连山区狭域分布的特有物种黑虎耳草进行居群遗传多样性研究。目的在于揭示该物种现有居群的遗传多样性水平及其分布格局，探讨其现有遗传格局的历史成因。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料于2015年和2017年采自青海省祁连山地区，共采集黑虎耳草8个居群115个个体，包括贵德县、门源县、大通县各1个居群，祁连县5个居群(表1；图1，a、b)。每个居群随机采集10～19个个体，个体之间间隔10 m以上。选取生长良好植株的新鲜幼嫩叶片，随即用硅胶干燥，带回实验室存放于-20 ℃冰箱备用。凭证标本由高庆波研究员鉴定，馆藏于中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆(青海，西宁)。

1.2 DNA提取与PCR扩增

采用改良的CTAB法从硅胶干燥的叶片中提取总DNA[24]。采用通用引物对所有个体的cpDNArbcL、trnS-G片段和nrDNA ITS片段进行PCR扩增[25-27]。PCR反应体系为50 μL，包含1.5 μL DNA模板 (20 ng/μL)，正反向引物各1 μL (10 μmol/L)，2 μL dNTPs (10 mmol/L)，5 μL 10 × PCR缓冲液 (含1.5 mmol/L Mg2+)，0.5 μL (5 U/μL) Taq DNA聚合酶(TaKaRa，大连)，39 μL双蒸水。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸3 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送北京新时代众合科技有限公司进行双向测序，测序引物同PCR扩增引物。

表1 黑虎耳草8个居群的采集信息

1.3 数据分析

首先利用Chromas 2.6.4软件对测序峰图进行核对，并删除引物序列[28]。利用MEGA 7.0.26软件对序列进行对位排列，并加以手工微调，然后裁剪成首尾整齐的序列[29]。将cpDNA 2个片段进行串联合并后，用DnaSP 5.10统计单倍型[30]。对于ITS序列，由于内转录间隔区1(ITS1)的测序结果不理想，本研究选取测序结果较好的5.8S核糖体RNA(5.8S rRNA)和内转录间隔区2(ITS2)序列进行后续分析。若ITS正反序列在某位点均显示套峰，且较弱峰图达到较强峰图的1/4，该位点被视为杂合位点[31-32]。利用DnaSP 5.10软件包中的PHASE 2.1软件对ITS序列进行单倍型重建[33-34]。随后对ITS序列的分析均基于分离出的ITS单倍型序列。

利用PERMUT软件计算居群内平均遗传多样性(HS)、总遗传多样性(HT)以及2个居群遗传分化系数GST和NST[35]。GST仅考虑单倍型频率，NST兼顾了单倍型频率和单倍型之间的相似性。用1 000次的重复置换检验对NST和GST进行比较，当NST显著大于GST时，表明居群在分布范围内具有显著的谱系地理结构。利用Arlequin 3.11计算每个居群的遗传多样性(h)和核苷酸多样性(π)[36-37]。利用Arlequin软件包中的分子变异分析(AMOVA)检测居群内和居群间的遗传变异分布格局，并对居群间遗传变异分化系数FST进行评价(1 000次置换检验)[36-37]。

中央连接网状图可以更好地揭示遗传分化较小的单倍型之间的系统发育关系。以最大简约法为原则，利用NETWORK 10.1.0.0软件构件cpDNA和ITS单倍型的中央连接网状图[38-39]。多碱基的插入/缺失和点突变被认为是通过一步突变形成，设置相同的权重。在中央连接网状图中，古老的单倍型多位于网络图的内部，年轻的单倍型多位于网络图的边缘[40-41]。

基于cpDNA数据进行歧点分布分析来预测黑虎耳草居群的历史动态。若歧点分布呈现单峰曲线，表明居群经历了近期扩张；若歧点分布呈现多峰曲线，则表示在较长的时间内居群大小相对稳定，并处于个体平衡中[42-46]。利用1 000次的自展重复来产生居群扩张模型的预期分布。Tajima’sD和Fu & Li’sD*两种无限突变位点模型的中性检验也被用来预测居群历史动态，显著的负值说明居群可能经历过近期扩张[47-48]。歧点分布分析和中性检验均在DnaSP 5.10软件中完成[30]。

2 结果与分析

2.1 单倍型/基因型变异位点和地理分布格局

DNA分子序列对位排列后，黑虎耳草8个居群115个个体cpDNA联合片段(rbcL、trnS-G)的序列总长度为1 269 bp(H1/H2/H3和H4中rbcL片段的GenBank登录号分别为MW296152和MW296153；H1、H2、H3和H4中trnS-G片段的GenBank登录号分别为MW296154、MW296155、MW296156和MW296157)。通过DnaSP软件分析，共得到4个单倍型(H1～H4)，检测出4个变异位点，其中1个位点为点突变，另外3个位点为插入/缺失(表2)。单倍型H2出现频率最高，出现在黑虎耳草所有8个居群中；其次为单倍型H3，出现在5个居群中；单倍型H1和H4分别只出现在祁连山东南部居群P1和P8中(图1，b；表3)。基于cpDNA数据的居群遗传多样性(h)变化范围为0～0.538 5；居群核苷酸多样性(π)变化范围为0～0.002 130(表3)。

由于ITS1的测序结果不理想，本研究选取5.8S+ITS2序列进行后续分析。对位排列后的序列长度为408 bp。利用PHASE软件进行单倍型分离，共得到9个单倍型(G1～G9，GenBank登录号分别为MW296143、MW296144、MW296145、MW296146、MW296147、MW296148、MW296149、MW296150和MW296151)，检测出10个变异位点(表4)。其中G1出现频率最高，出现在所有8个居群中，其余ITS单倍型多为居群特有单倍型，绝大部分只出现在祁连山东南部居群中(P7、P8)。基于ITS数据的居群遗传多样性(h)变化范围为0～0.609 2；居群核苷酸多样性(π)变化范围为0～0.003 589(表3)。

表2 黑虎耳草cpDNA单倍型变异位点

2.2 单倍型间的系统发育关系

cpDNA和ITS单倍型检测出较少的突变位点，表明序列之间的遗传分化较小。Network软件可更好地揭示系统进化关系较近的序列之间的系统发育关系。基于最大似然法构建的中央连接网状图显示，居群共享单倍型，如cpDNA H3和ITS G1，位于网络图的中央位置，根据溯祖理论，推测为较古老的单倍型。居群特有的单倍型一般位于网络图的边缘，可能是通过近期分化衍生而来的年轻单倍型(图1，c、d)。

2.3 居群遗传结构

基于cpDNA数据计算得出黑虎耳草居群内平均遗传多样性(HS)为0.257、总遗传多样性(HT)为0.464，两个遗传分化系数GST和NST分别为0.447和0.513。NST大于GST但不显著，表明黑虎耳草在整个分布范围内没有明显的谱系地理结构。ITS数据揭示了相似的居群遗传结构：HS= 0.194，HT= 0.219，GST= 0.112，NST= 0.122；NST>GST(P> 0.05)。基于cpDNA和ITS数据的分子变异分析结果均表明，黑虎耳草现有遗传变异主要存在于居群内(cpDNA: 51.83%; ITS: 87.84%)，居群遗传分化系数(FST)分别为0.481 75和0.121 56(表5)。

a、b饼状图表示每个居群中cpDNA(实线)和ITS(虚线)单倍型的频率；c、d分别为基于cpDNA和ITS单倍型构建的中央连接网状图图1 黑虎耳草8个居群的采样图及cpDNA和ITS单倍型分布图a and b pie charts show the proportion of haplotypes of cpDNA (solid line) and ITS (dashed line) within each population; c and d show the median-joining networks based on haplotypes of cpDNA and ITS, respectivelyFig.1 A map showing the eight sampled populations of S. atrata and the distribution of cpDNA and ITS haplotypes

表3 黑虎耳草8个居群的单倍型/基因型组成及多样性信息

表4 黑虎耳草ITS单倍型变异位点

表5 黑虎耳草8个居群的分子变异分析

2.4 基于cpDNA联合序列的居群历史动态分析

对黑虎耳草cpDNA联合序列所有个体进行中性检验，结果表明，Tajima’sD(-1.012 30，P> 0.05)和Fu & Li’sD*(-2.066 77，P> 0.05)均为负值，均不显著。歧点分布分析结果显示，在黑虎耳草整个分布范围内观测到的歧点分布与居群扩张模型预测值高度一致(图2)，说明该物种在整个分布范围内经历过近期扩张现象。

图2 黑虎耳草115个体叶绿体DNA联合片段歧点分布分析Fig.2 Mismatch distribution analysis for the 115 individuals based on combined cpDNA fragments of S. atrata

3 讨 论

3.1 黑虎耳草的居群遗传结构和进化历史

狭域分布物种是否具有较低的遗传多样性仍存在争议[49]。一般认为，与同属广域分布物种相比，狭域分布物种往往具有较低的遗传多样性。这是因为，狭域分布物种更容易受到如下因素的影响：1)较小的有效居群大小；2)奠基者效应和瓶颈效应；3)遗传漂变和近交衰退；4)较低的扩散能力和竞争能力[4]。然而，Gitzendanner对分别来自同属的30多对狭域/广域分布物种的遗传多样性进行比较，发现上述观点过于概括[49]。受亲缘关系远近的影响，有些属植物的遗传多样性普遍较高，有些属的普遍较低，而对于同属植物来说，大部分情况下狭域分布物种的遗传多样性比广域分布物种低，少部分狭域物种的遗传多样性与广域物种相当，甚至更高[49]。

物种水平的总遗传多样性(HT)常被用来比较不同物种间的遗传多样性水平[49]。基于cpDNA和ITS数据的遗传变异分析表明，黑虎耳草总遗传多样性水平较低(cpDNA：HT= 0.464；ITS：HT= 0.219)。明显低于虎耳草属其他青藏高原-喜马拉雅广域分布物种，如山地虎耳草(Saxifragasinomontana；cpDNA：HT= 0.978；ITS：HT= 0.896)[7]、小伞虎耳草(S.umbellulata；cpDNA：HT= 0.964；ITS：HT= 1.000)[13]、篦齿虎耳草(S.pasumensis；cpDNA：HT= 0.835；ITS：HT= 0.973)[13]、唐古特虎耳草(S.tangutica；cpDNA：HT= 0.933)[19]、优越虎耳草(S.egregia；cpDNA：HT= 0.868)[20]等。这可能是由于：1)所选的分子片段进化速率较慢，低估了黑虎耳草物种水平和居群水平的遗传多样性；2)黑虎耳草在居群历史进化中经历了严重的奠基者效应和瓶颈效应。真核生物核糖体DNA内转录间隔区(ITS)被5.8S rRNA基因分为内转录间隔区1(ITS1)和内转录间隔区2(ITS2)[50]。其中，5.8S rRNA基因较为保守，而ITS1和ITS2变异速率较快。由于ITS1区域测序结果不理想，本研究仅使用5.8S和ITS2区域的序列会低估基于ITS数据计算出的黑虎耳草物种水平和居群水平的遗传多样性。然而，本研究选用的cpDNA分子标记与小伞虎耳草和篦齿虎耳草相同[13]。基于cpDNA数据计算出的黑虎耳草遗传多样性远低于后者，说明黑虎耳草本身遗传多样性较低，而不是由于分子片段的选择偏向。黑虎耳草物种水平和居群水平较低的遗传多样性可能与该物种的居群进化历史有关。

第四纪冰期和间冰期循环所引起的气候波动对物种的遗传分化和特有物种形成产生了深远影响[51-52]。谱系地理学通过研究物种现有的遗传分布格局，推测其历史成因，重建生物区系进化历史[53]。由于独特的地质气候历史和复杂的地理拓扑结构，青藏高原及其周边地区的高山植物对第四纪冰期的响应表现出不同的谱系地理模式[54]。其中一种模式认为，冰期时青藏高原台面的居群退缩到海拔较低的东南部边缘避难所内，间冰期或冰期后重新扩散到高原台面。与之相对应的遗传多样性分布格局为，高原东南部边缘避难所内的居群由于分化时间较长积累了较多的遗传变异，拥有较多的单倍型和特有单倍型，具有较高的遗传多样性。而高原台面的居群由于回迁过程中的奠基者效应仅固定少数分布广泛的单倍型，常呈现出较低的遗传多样性。位于祁连山脉东南部的黑虎耳草居群，如P1、P7和P8，固定了几乎所有的cpDNA单倍型和ITS基因型，并具有较高的基因多样性和(或)核苷酸多样性。而祁连山西北部的居群仅固定少数广泛分布的cpDNA单倍型和ITS基因型，基因多样性和核苷酸多样性普遍较低。根据黑虎耳草居群现有的遗传分布格局推测，第四纪冰期时该物种退缩到祁连山东南部边缘避难所，间冰期或冰期后回迁到祁连山西北部地区。这也得到了中性检验和歧点分布分析的支持。虽然中性检验呈现不显著的负值，而歧点分布分析结果显示，在黑虎耳草整个分布范围内观测到的歧点分布与居群扩张模型预测值高度一致，说明该物种在整个分布范围内经历过近期扩张现象。符合上述谱系地理模式的物种还有长花马先蒿(Pedicularislongiflora)[55]、青海云杉(Piceacrassifolia)[56]、祁连圆柏(Juniperusprzewalskii)[57]等。然而，狭域分布物种由于居群较小且相互隔离，更易受到瓶颈效应和遗传漂变的影响，导致黑虎耳草呈现较低的遗传多样性。

3.2 保护生物学建议

狭域分布的特有物种常呈现出较低的遗传多样性，更易受到环境波动和人类活动的影响，成为保护生物学关注的热点[3-4]。青藏高原地理拓扑结构复杂、生境多样、生态位分化明显，是世界生物多样性热点地区，也是世界上特有种密度最高的地区之一[58]。黑虎耳草为狭域分布的特有物种，只分布在祁连山区，生于高寒草甸和流石滩。该物种各居群间相互隔离，每居群个体数较少。较小的居群常不足以抵消遗传漂变、近交衰退及生境随机波动的影响[3]。

所幸的是，黑虎耳草的绝大多数居群位于祁连山国家公园范围内，最大限度地限制了人类活动对该物种的影响，有助于该物种居群大小的稳定和增长。居群遗传分布格局研究有助于保护策略的制定，可以在自然居群中最大限度地保存物种的遗传多样性。值得注意的是，固定特有单倍型或基因型最多的2个居群P1和P8，位于祁连山国家公园范围之外。建议对这些区域进行持续稳定的生态监测，避免放牧强度过高，维持生态系统的相对稳定，需要时可以对这2个居群进行种质资源搜集并实施迁地保护。黑虎耳草作为一种藏药，尝试开发其规模繁殖的方法可以减轻对野生资源的需求压力，对保护其多样性也有一定积极意义。