卞 展， 刘小金，洪 舟， 张宁南，孟 森， 徐大平

(中国林业科学研究院 热带林业研究所，国家林业和草原局热带林业研究重点实验室，广州 510520)

檀香(SantalumalbumL.)为檀香科(Santalaceae)檀香属半寄生小乔木，主要分布于印度、印尼和澳洲等地区[1]。檀香心材含有独特香气，主要用于高档家具制造。同时，从檀香心材提取出的精油是高级化妆品和医药行业的重要原料。檀香是檀香属中经济价值最高的珍贵用材树种[1-3]。全世界檀香的年需求量估计在1万吨以上，而年产量只能满足约四分之一，市场供需矛盾十分突出，价格日益昂贵。然而在巨大经济利益驱动下，过度开发和非法贸易导致檀香野生自然资源破坏殆尽，濒临灭绝[4]。

檀香是一种半寄生植物，其叶片具有正常的光合作用能力，但其部分根系必须通过特化的寄生器官——吸器侵入邻近植物根系上，通过木质部融合连接，从寄主体内摄取生长所需要的水分和营养[5]。选择一种适宜的寄主植物会直接影响檀香各培育阶段的成活率和生长状况，这对于檀香人工栽培来说至关重要，而吸器的形成及能否成功侵入寄主植物是檀香人工造林成败的关键。吸器是寄生植物与寄主植物建立水分和养分传递的通道，但吸器发育的诱导因子和发育过程十分复杂。许多特定的化学物质如苯醌类、香草酸、松柏醇及激素(细胞分裂素、生长素)均能诱导寄生植物吸器的形成[4-13]。研究表明，醌还原酶QR1通过催化 2,6-二甲氧基对苯醌(DMBQ)及其衍生物产生活性氧(ROS，reactive oxygen species)，可以诱导吸器形成[6-8]。这些吸器诱导因子(haustorium-inducing factors，HIFs)可能通过启动信号转导级联，导致寄生植物根中活性氧的积累进而诱导吸器的形成[9-14]。但是到目前为止，寄生植物独特的吸器发育过程仍旧缺乏系统研究，其分子机理十分欠缺。

植物Rac蛋白家族属于低分子量GTP结合蛋白ROP家族，根据其C端保守基序和转录后修饰，分为Rac Ⅰ和Rac Ⅱ两个亚家族[15]。两类Rac蛋白广泛参与侧根发育、花粉管极性生长、次生细胞壁合成及细胞程序性死亡等信号途径的调控，因此又被称为“分子开关”[15-17]。Rac分子开关的功能状态主要取决于结合GTP或GDP的状态：当与GTP结合时处于激活状态，有功能活性；当与GDP结合时，处于失活状态，无功能活性[17]。目前研究普遍认为Rac蛋白是通过互作激活呼吸爆发氧化酶蛋白(Rboh)，进而产生ROS信号介导调控各种生理途径[15,18-19]。前期研究中发现檀香SaRboh蛋白受到吸器诱导因子DMBQ的显著诱导，且SaRboh蛋白产生的ROS信号是檀香吸器发育所必需，但Rac蛋白是否也参与了檀香吸器的形成过程仍不清楚。

本研究以檀香为材料，对檀香SaRac1基因进行了克隆及生物信息学分析，并对其亚细胞定位、组织表达特性、对吸器诱导因子响应等进行了分析，为探究SaRac1基因调控ROS信号并介导檀香吸器发育的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试檀香(SantalumalbumLinn.)材料为本实验室保存，种植于中国林业科学研究院热带林业研究所(广州，23°11′N, 113°23′E)。取幼叶、成熟叶、老叶、茎、根、吸器6个组织样品，每个组织3个生物学重复，冻存于-80 ℃冰箱。

基因克隆所用大肠杆菌DH5α、pSuper载体为林木遗传与育种国家重点实验室保存。反转录试剂盒、高保真酶、荧光定量试剂盒购自天根公司。RNA快速提取试剂盒购自Omega 公司。pEASY无缝克隆试剂盒购自北京全式金公司。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取、cDNA合成与基因克隆cDNA根据植物RNA提取试剂盒(Omega，R6834-01)操作说明书，提取檀香总RNA。琼脂糖凝胶和紫外分光度计(Nanodrop 2000，赛默飞公司，美国)检测RNA质量和浓度。利用天根反转录试剂盒反转录为cDNA，根据檀香基因组数据得到的SaRac1基因序列，设计上游引物(5′-ATGAGCGCATCAAGATTCA-3′)和下游引物(5′-TAGTATGGAGCAGGCCTTCTGTACCT-3′)进行PCR扩增，产物纯化回收后，一步法无缝连接到pSuper载体，化学转化至DH5α感受态细胞，经氨苄霉素抗性筛选后，挑取单克隆并进行PCR鉴定及测序。

1.2.2SaRac1基因生物信息学分析SaRac1基因和蛋白序列比对通过Clustal W软件进行；蛋白质理化性质(分子量、等电点、亲水性系数)通过ProtParam 软件(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析[20]。蛋白亚细胞定位利用WoLF PSORT 软件(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)在线预测[21]。SWISS-MODEL同源建模预测其蛋白三级结构[3]。系统进化用MEGA 6.0软件进行分析绘制[3]。

1.2.3 SaRac1蛋白亚细胞定位将SaRac1无缝连接到pBWA(V)HS载体(35S：SaRac1-GFP融合表达)，参照课题组之前方法制备拟南芥叶片原生质体并瞬时转化，NLS-mKate 作为核定位marker，采用Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜观察SaRac1蛋白定位[22]。

1.2.4SaRac1基因组织表达特异性分析以檀香Actin基因为内参基因(上游：5′-CTCATTTTGCCAGGCCGAAT-3′，下游：5′-CTCTTTACCCAGTACCGGCA-3′)，利用Primer 3.0软件设计实时荧光定量PCR引物。分别提取檀香幼叶、成熟叶、老叶、茎、根、吸器6个组织RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，实时荧光定量PCR参照SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ Kit(天根生物)说明书进行，设计上游引物(5′-AGGGTTGTGGGATACTGCTG-3′)和下游引物(5′-AAAGCTGGCCTTGCTAATGA-3′)，反应体系为：SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dd H2O 6 μL。反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行45个循环。3次生物学重复，3次技术重复。

1.2.5SaRac1基因对吸器诱导因子的响应分析从中国林业科学院热带林业研究所苗圃中选取长势一致的檀香幼苗(高度10 cm)，采用温室控制盆栽试验，将檀香移植于盆中央(泥炭土∶蛭石∶珍珠岩=3∶2∶2，v/v/v)，待檀香幼苗生长相对稳定后，每周浇霍格兰营养液浇100 mL，持续4周，选择长势一致的幼苗，添加10 μmol/L 2, 6-二甲氧基对苯醌(寄生植物吸器诱导因子)为处理，不添加任何物质为空白对照，10 μmol/L 的2, 6-二叔丁基苯醌(DBQ)为阴性对照。以早上8：00为处理的时间起点，分别在处理后0、0.5、1、2、4、8和24 h取根样品，3个生物学重复，以Actin基因为内参基因，检测SaRac1基因对各个处理的表达响应，同时统计1个月后的檀香根部吸器数量。每个处理设置3个生物学重复，并进行3个技术重复。采用SPSS20.0进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 SaRac1基因克隆

通过设计引物，对SaRac1开放阅读框进行扩增，经克隆测序得到该基因大小为594 bp，编码197个氨基酸(图1)。利用在线分析软件对蛋白基本理化性质进行预测，发现SaRac1蛋白分子量约21.55kD，理论等电点9.32，亲水性系数为-0.083，为亲水性蛋白, 不含跨膜结构域和信号肽。通过分析，该蛋白在N端为保守的G结构域，包括：GTP酶活性结构域(G1、G3)、Mg2+离子结合效应区(G2)和GTP结合位点(G4、G5)。其中G2、G3结构域也称转换结构域Ⅰ和Ⅱ (switch Ⅰ and Ⅱ loops)，第21位和156位为G结构域保守的半胱氨酸残基(图1)。蛋白C端具有CaaL保守基序，其上游具有高度可变的富含碱性氨基酸区域，使蛋白C端形成了可富集正电荷的游离尾部(图1)。同时檀香SaRac1和拟南芥Rac基因家族进化树分析表明，SaRac1蛋白和AtRac1～6、AtRac9和AtRac11蛋白同属于典型且保守的植物Rac Ⅰ 家族蛋白(图2)。

At. 拟南芥；Os. 水稻；Sa. 檀香图1 檀香SaRac1蛋白结构域预测结果At. Arabidopsis thaliana；Os. Oryza sativa；Sa. Santalum albumFig.1 Domain prediction of SaRac1

At. 拟南芥；Sa. 檀香图2 檀香SaRac与拟南芥AtRac蛋白的进化树分析At. Arabidopsis thaliana；Sa. Santalum albumFig.2 Phylogenetic tree analysis of Rac proteins from Santalum album and Arabidopsis thaliana

2.2 SaRac1蛋白亚细胞定位

通过拟南芥原生质体转化的方法进一步检测了SaRac1蛋白的亚细胞定位，以带有GFP空载体为对照，通过比较SaRac1蛋白融合GFP的载体定位情况，发现SaRac1蛋白主要定位在细胞核和细胞质(图3)。

2.3 SaRac1基因组织特异性分析

由图4可知，SaRac1基因在檀香各个组织均有表达，但组织间表达水平差异很大。在根和吸器中表达量最高，幼叶和茎中表达量较高，而在成熟叶和老叶中表达量最低。以成熟叶中SaRac1表达量作为衡量标准，SaRac1基因在根和吸器中表达量分别是成熟叶的8和6.7倍，而幼叶、茎和老叶中表达量分别为成熟叶的2.8、2.6和0.6倍。

不同字母表示处理间差异显著，P < 0.05，下同图4 檀香SaRac1基因在不同组织中的相对表达量Different letters represent significant differences among tissues, P < 0.05. The same as belowFig.4 Relative expression level of SaRac1 gene in different tissues of S. album

35S∶GFP表示GFP空载体；SaRac1-GFP表示SaRac1蛋白和GFP蛋白融合表达载体；NLS-mKate表示核定位marker图3 檀香SaRac1蛋白亚细胞定位35∶GFP was plasmid containing GFP alone; SaRac1-GFP was fusion plasmid; NLS-mKate was used as a nuclear localization markerFig.3 Subcellular localization of SaRac1

图5 不同处理对檀香SaRac1基因相对表达量和檀香吸器数量影响Fig.5 The relative expression level of SaRac1 gene and haustoria development after treatments

2.4 SaRac1基因对吸器诱导因子的响应分析

采用RT-PCR方法，对吸器诱导因子DMBQ处理不同时间后SaRac1的响应情况进行了分析。与空白对照和DBQ阴性对照相比，SaRac1基因受到吸器诱导因子DMBQ强烈诱导，且在4 h时表达量最高；同时，DMBQ处理显著促进了檀香吸器发育，其吸器数量分别比空白对照和阴性对照提高55.51%和80.96%(图5)。

3 讨 论

植物Rac蛋白通过与下游不同的蛋白耦合，广泛参与根毛发育、激素信号转导、抗逆等生理过程[23]。植物Rac蛋白通常都有GTP酶活性结构域、Mg2+离子结合效应区、GTP结合位点等保守结构域。但这些蛋白的C末端结构差异较大，此结构决定着Rac蛋白在细胞内的定位[19]。一般认为，Rac蛋白一般与质膜耦联或者游离于细胞质中[23]。檀香Rac1蛋白和其他植物Rac蛋白类似，包含所有的保守结构域，其C末端结构为CSIL[19,23]。本研究采用原生质体进行亚细胞定位试验发现部分SaRac1蛋白定位在细胞质中，这与之前报道的很多植物Rac蛋白类似[19]。但是意外的是，与之前报道的植物Rac蛋白不同，我们在细胞核中也检测到了大量的SaRac1蛋白，表明SaRac1蛋白在细胞核内可能也行使着独特的生物学功能。

为了解SaRac1基因的组织表达模式，本研究通过定量PCR方法检测檀香6个组织中SaRac1的表达情况。结果表明，SaRac1基因在根和吸器中表达水平较高。一般而言，蛋白在特定组织的表达情况往往与其功能密切相关[24]。SaRac1基因在根和吸器中表达水平较高暗示着该基因可能参与了吸器发育过程。

在水稻中过表达OsRac1基因可产生大量的ROS，且伴随着大量的抗病基因表达和植保素合成，进而表现出很强的稻瘟病抗性[25]。在拟南芥中，过表达AtRac1基因也可以诱导产生大量ROS，但这种诱导作用可以被NADPH氧化酶抑制剂DPI所抑制，说明DPI可以抑制Rac1依赖的活性氧产生[25-26]。植物Rac蛋白的一个重要功能就是通过调节植物NADPH氧化酶活性进而参与ROS产生[27]。我们的前期研究表明，ROS信号是檀香吸器发育所必需[3]。在本研究中，吸器诱导因子DMBQ显著促进了檀香吸器发育，同时SaRac1受到吸器诱导因子DMBQ的强烈诱导，这些结果暗示着SaRac1可能通过ROS生成参与了檀香吸器发育过程。在后续研究中，我们将通过遗传转化和生化试验进一步探究SaRac1调控ROS信号生成的机理，并进一步验证檀香吸器发育是否受该过程的影响。

目前，对寄生植物特有的吸器发育过程而言，分子机理水平研究十分欠缺。SaRac1蛋白受到吸器诱导因子DMBQ的显著诱导，且与ROS信号密切相关。本研究对该基因进行了克隆、亚细胞定位和表达模式分析，并初步验证了该基因参与了吸器发育过程，为深入研究SaRac1参与调节ROS信号和吸器发育过程奠定基础。