李晓勇, 宋来春, 陶 超, 金 晶, 许 铭

(武汉科技大学附属武汉亚洲心脏病医院 心外科 职业危害识别与控制湖北省重点实验室, 湖北 武汉 430022)

先天性心脏病 (congenital heart disease, CHD) 占儿童出生缺陷率的首位，发病率高，危害大，其病因仍然不明[1]。近期研究表明，基因异常在其发病机制中起重要作用。唐氏综合征是最常见的导致CHD的遗传性疾病，其21号染色体上的钙调磷酸酶调节蛋白1基因(regulator of calcineurin 1, RCAN1)被证明是先天性心脏缺陷相关的致病基因[2-3]。RCAN1主要有2个亚型，RCAN1-1主要在中枢神经系统表达，RCAN1-4主要在心肌、胎儿肾脏中表达，这种组织特异性表达的机制不清[4]。因此本课题拟从转录调控入手，研究RCAN1基因不同亚型的启动子区转录因子结合位点的差异，探索其在人体内特异性表达的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RCAN1基因及其上游的序列参照RefSeq (NG-007071.1) 以及UCSC、LOVD、千人基因组计划等数据库。定点突变试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, TOYOBO公司)。荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega公司)。荧光定量PCR试剂盒 (GoTaq qPCR Master Mix, Promega公司)。光辉霉素(18378-89-7，Amresco公司)。RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆及定点突变： RCAN1-1和RCAN1-4分别通过两个不同的启动子来转录，两个启动子区分别位于第1和第4外显子的上游。在TRANSFAC数据库中通过在线生物信息学软件AliBaba 2.1预测两个启动子区所有可能的转录因子结合位点(http://www.gene-regulation.com)，结合既往文献报道及物种属性(只在人体内表达)，再对比分析两个启动子区的差别，初步筛选出一个具有差异性的候选转录因子结合位点：Sp1，位于第1外显子上游-129至-138碱基位置，符合Sp1经典结构nyCCGCCsmC。……