周 璐，雷 航，洪 叶，金 爽，董永勤，王学锋，蔡晓红

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院舟山分院输血科，浙江 舟山 316000；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科，上海 200025）

ABO 血型血清学鉴定是临床输血前必须进行的重要检测，而ABO 血型亚型是导致血型血清学实验中正反定型不一致、定型困难的重要原因。很多ABO 亚型者具有特异性的表型，以血型血清学试验显示为抗原性弱为主要特征，而经血型血清学确定为红细胞相同ABO 亚型者，经抗原分子水平、糖基转移酶和基因水平等研究亦证实其存在着异质性[1]。本研究团队在对1 例ABO 血型正反定型不一致的患者及其家系进行鉴定分析时，发现了1 个新的导致AwB 亚型的ABO*A 等位基因，现报道如下。

对象与方法

一、对象

先证者为健康体检者，女性，53 岁，汉族，既往无特殊病史，无输血献血史，家族中无遗传病史。因先证者的ABO 血型鉴定初次检测正反定型不一致，后采用试管法进行复检。并采集先证者的外周静脉血标本5 mL，用K2-EDTA 抗凝后进行分析。

二、方法

1.试剂和仪器：本研究所用试剂包括单克隆抗-A、抗-B (批号20200201)、抗-H 血清 (批号20190114)、抗-A1血清(批号20101207)和ABO 反定型红细胞 (批号20215310)(购自上海血液生物医药有限公司)，人源性抗-A、抗-B 试剂(上海血液中心参比实验室馈赠)，血液基因组DNA 提取试剂盒(批号R6703，天根生物产品)，通用型DNA 纯化回收试剂盒(批号S8202，天根生物产品)；所用仪器包括细胞洗涤离心机(KA-2200 型，日本久保田)和测序仪(ABI377，美国Applied Biosystems)。

2.血型血清学检测：ABO 正反定型和抗体筛选使用全自动血型仪Biovue (美国强生公司)和IH1000(美国BioRad 公司)进行初次检测，按血型参比实验室标准操作方法进行试管法ABO 血型复检[2]。

3.基因组DNA 提取和PCR 扩增：使用天根血液DNA 基因组抽提试剂盒抽提受检者的外周血基因组DNA,按试剂盒说明书操作。对先证者进行ABO 基因扩增。PCR 检测中使用的引物根据ABO基因序列 (GenBank Accession Number N_000009)参照文献[3]进行设计，扩增条件为，95 ℃3 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，共30 个循环；最后72 ℃，延伸8 min。

4.PCR 产物克隆及测序：采用通用型DNA 纯化回收试剂盒(天根生物产品)纯化PCR 产物，并使用ABI377 测序仪(美国Applied Biosystems 公司)对ABO 基因7 个外显子序列进行直接测序。将先证者第6 至第7 外显子的PCR 纯化产物克隆入pMD18-T 载体(TaKaRa 公司产品)，进行单倍型鉴定。

5.ABO 等位基因命名：根据国际输血协会(International Society of Blood Transfusion,ISBT)的命名方式对ABO 等位基因和突变进行命名。

6.突变对GTA 蛋白结构影响的预测：对检出新突变导致的A 酶突变体GTA-p.L280F 进行结构模拟分析。以人类糖基转移酶A(GTA，PDBID：3SXE，对应基因型A1.02)的晶体结构为分子模型，采用Chimera 软件(版本1.1University of California，S1.2，San Francisco，CA)进行突变体构建，并对突变后的分子结构进行分析[4]。GTA蛋白3D结构图的绘制采用PyMol软件[DeLano，W.L.the PyMOL Molecular Graphics System(2003-2011)，版本1.4.1，DeLanoScientific，San Carlos，CA]。

结果

一、血型血清学鉴定

先证者体检时自动血型检测系统发现其红细胞与单克隆抗A、抗B 试剂反应分别呈弱阳性(2+)和强阳性(4+)，与抗A1 血清反应呈阴性，先证者血浆与试剂A 细胞和B 细胞反应，结果分别为弱阳性(0.5+)和阴性，不规抗体筛查未见异常。进行试管法复检，结果发现先证者的血清学表现为正反不符，人源性抗A 和抗B 分别呈弱阳性(2.5+)、强阳性(4+)，其红细胞上的H 抗原较正常A 型红细胞无明显增强，抗H-Bc、抗H-Oc、抗H-Pc 分别为0.5+、2+、0.5+。由于缺乏先证者的唾液样本，所以无法确定明确的表型。

二、DNA 测序及克隆分析

先证者A 等位基因与ABO*A1.01 相比，第7外显子存在c.467C>T 和c.838C>T 错义突变(见图1)。这2 个突变分别被报道为ABO*A1.02 和ABO*A3.03 等位基因的关键位点，但两者顺式表达的等位基因在ISBT 数据库和既往国内外文献中均未见报道。此先证者基因型为ABO*Avar/B.01。

图1 先证者PCR 测序结果

三、GTA 空间模型分析

基因测序和克隆结果分析显示，本例先证者在A3.03 等位基因的基础上发生c.467C>T，而相较于A1.01 等位基因，A1.02 基因第7 外显子第467 位发生C>T 碱基突变(c.467C>T)突变，使第156 位的脯氨酸(Pro)变成亮氨酸(Leu)(p.P156L)突变不影响蛋白结构和功能[5]，故本次GTA 功能发生改变可能是c.8238C>T(p.L280F)突变导致的。对p.L280F突变进行3D 分子模型构建与局部结构分析，发现该突变未导致GTA 蛋白整体结构的改变(见图2A、2B)，但却改变了280 位氨基酸与邻近氨基酸的静电作用力，L280 可分别与276 位、284 位氨基酸形成氢键(见图2C)，而F280 则可与283 位及284 位形成氢键(见图2D)，改变了邻近氨基酸间的作用力，导致局部构象的改变。

图2 野生型GTA 与p.L280F 突变GTA 的分子模型

讨 论

一、先证者血清学鉴定结果显示为AwB 亚型

ABO 血型亚型是由于基因突变，导致红细胞表面A 抗原或B 抗原表达数目减少，与抗A 或抗B血清反应出现凝集强度减弱的现象，具有遗传基础和明确的血清学特点[6]。正常A 型红细胞与抗A1的凝集强度可达到4+，但本例先证者的红细胞与抗A1几乎无反应[7]；A 亚型与抗H 凝集强度普遍强于正常同型红细胞[8]。A3型红细胞的典型特征是出现混合视野凝集[9]，有些亚型如Ax、Ael，其血清中经常存在抗A1抗体[10]，可以作为与其他A 亚型进行鉴别的特征；Ael亚型常规的实验方法检测不出A 抗原，但吸收放散实验能够检出弱的A 抗原[11]。类孟买血型也存在红细胞A 或B 抗原缺失或弱表达，但类孟买型红细胞由于缺乏H 抗原，一般不与抗H发生凝集，因此，可应用抗H 加以区分[12]。本研究先证者为抗A 弱阳性，抗A1阴性，抗B 强阳性，人源性的抗A 和抗B 也分别为弱阳性和强阳性，抗H无明显加强。因该先证者存在一个正常的B 等位基因，故其红细胞上的H 抗原可不增强[13]。本研究由于缺乏先证者的唾液样本，无法确定明确的表型。

二、先证者基因型为ABO*Avar/B.01

血型血清学试验不能作为患者ABO 血型亚型的结论，还应进行ABO 血型基因分型及基因测序，完成家系调查，明确亚型形成的遗传学原因。基因测序分析显示，本研究中先证者的A3.03 等位基因存在c.467C>T 突变。我国台湾地区报道的A3B 型个体中也发现了c.838C>T 错义突变，预测编码的A1.01 等位基因第280 位亮氨酸(Leu)转变成苯丙氨酸(Phe)[14]，该等位基因被命名为A3.03 等位基因。区别于已报道的病例，本研究中先证者在A3.03 等位基因存在c.467C>T(p.P156L)突变。

A3亚型红细胞最大特征为镜下呈混合视野凝集，即A3红细胞与抗A 及大多数抗AB 孵育后出现一些有数个红细胞形成的小凝集块，并被绝大部分游离的非凝集红细胞包围[15]。虽然经测序证实，本研究中先证者标本含有罕见的A3等位基因，但其未出现A3亚型经典的混合视野，因此血清学鉴定为AwB 型。这提示血清学表现存在个体差异，血清学和基因型结果并不完全对应。此现象在ABO亚型中并不少见，即同样的基因型可以有不同的血清学表现[16-18]，尤其是在和不同的ABO 等位基因共表达时[19]。如有研究曾报道，ABO*A3.07 等位基因表型未检出混合视野 (3 例ABO*A3.07/B.01，2 例ABO*A3.07/O01.01，1 例ABO*A3.07/O01.02)[20-21]，被认为可能与不同实验室使用的抗血清试剂存在差异有关[18]，也可能是由于血型血清学鉴定结果明显受血样本新鲜程度限制，而分子生物学技术分析可不受影响[9]。

三、p.L280F 导致GTA 局部构象改变

另外，针对c.838C>T(p.L280F)突变，本研究对先证者突变蛋白的结构和功能，进行了相关研究。在模拟的GTA 的3D 分子模型分型中，发现其未导致GTA 蛋白整体结构的改变，但却改变了280 位氨基酸与邻近氨基酸的静电作用力，L280 可分别与276 位及284 位氨基酸形成氢键，而F280 则是与283 位及284 位形成氢键，导致局部构象的改变，这可能是导致该先证者出现AwB 亚型的原因。

c.838C>T(p.L280F)突变，即A3.03，在人群中较为罕见，既往报道出现在A3B 型个体中[14,22]。c.467C>T(p.P156L)突变，在我国汉族人群中很常见，主要见于A1.02 等位基因，其出现频率为0.197 8[23]，相应表型为正常A 型，但该突变生成的糖基转移酶并不影响酶活性[24]，也不影响蛋白结构和功能,所以该突变点并非导致AwB 亚型的根本原因。基因突变造成其编码的糖基转移酶结构和活性改变，导致血型抗原合成异常，客观解释了血型抗原抗体在质和量的差异性原因[25]。所以可知，c.838C>T(p.L280F)突变是导致本研究先证者A 型糖基转移酶活性极大降低的原因。

总之，p.L280F 突变可能通过改变邻近氨基酸间的作用力，导致A 酶活性减弱，在与B 等位基因共表达时形成AwB 亚型。但该突变如何进一步导致酶活性减弱的机制，还需要进一步行体外实验证实。更重要的是针对AwB 亚型，对其突变与功能关系进行研究，了解其分子机制，为血型鉴定与安全输血提供科学依据，是未来精准医疗不可缺少的部分。