黄帅帅，岑东

作者单位： 315010 宁波，宁波市鄞州区第二医院

肾癌是一类来源于肾小管上皮系统的恶性肿瘤，其中肾细胞癌（RCC）占肾脏所有原发性恶性肿瘤的80%～90%，发病率仅次于膀胱癌居泌尿系统恶性肿瘤的第二位。RCC 对常规放化疗不敏感，目前手术治疗是局部RCC 的主要治疗手段，而免疫治疗、靶向药物和化学疗法是针对晚期和转移性RCC 首选治疗方法。虽新的RCC 诊断方法和治疗药物方面取得了重大进步，但其发病率和死亡率仍然很高，且日益上升，严重威胁人类健康。因此，筛选灵敏度高、特异性强的RCC分子标志物以提高其早期诊断、改善远期疗效已成为当前相关研究的热点之一。外周血循环游离核酸（CNAs）是指在人体外周血中游离于细胞外的核酸片段，主要有循环游离脱氧核糖核酸（cfDNA）和循环游离核糖核酸（cfRNA）两类。肿瘤患者的CNAs 往往含有与肿瘤部分遗传物质相一致的特征性改变，借助于分子生物学技术，在肿瘤发生早期，即可从患者外周血中检测到肿瘤特异性CNAs，为肿瘤的无创诊断、性质确定、肿瘤细胞分化与进展乃至预后评估提供重要依据，有助于肿瘤临床诊断和用药指导。本文就近年来这一领域的主要研究进展综述如下。

1 cfDNA

cfDNA是存在于人体外周血并游离于细胞外的DNA 片段。早在20 世纪40 年代，有研究发现人外周血中可分离出CNAs 分子，然而并未受到广泛关注。直至1994 年，Sorenson 等在胰腺癌患者外周血中发现了与其肿瘤组织相一致的K-ras突变基因，认为该突变基因由肿瘤细胞释放并具肿瘤特异性，可用于肿瘤的诊断、治疗及预后评估。之后陆续有研究发现肿瘤患者cfDNA 存在DNA 序列反转、缺失、点突变、微卫星改变及启动子甲基化等异常。

由于cfDNA 在人外周血中以双链形式存在，故其稳定性较好。cfDNA 的来源目前尚无定论，一般认为主要由肿瘤细胞以非致病性地凋亡和坏死途径释放进入外周血，健康人群中含量为1 ～10 ng/ml，而肿瘤患者中显著增加，这种差异使得cfDNA 具备作为肿瘤分子标志物的特征，为肿瘤临床早期诊断、预后及随访提供无创、便捷和高效的检测方式。

RCC 患者的外周血cfDNA 表达量高于健康对照人群，并且随着RCC 血管侵犯程度增加，其cfDNA 完整性下降。另外，cfDNA 表达量与RCC 预后效果呈负相关，肾切除术后出现复发的RCC患者的血cfDNA 水平高于未复发者，这表明cfDNA 在RCC 血行转移方面具有潜在的预测价值。除了细胞核来源的cfDNA外，外周血中线粒体来源的cfDNA（mt-cfDNA）在健康人群和RCC 患者中也存在显著差异。Lu 等在检测RCC 转移患者、非转移患者与健康对照人群血mt-cfDNA 时发现，mt-cfDNA 含量在RCC 转移组最高，RCC 非转移组次之，健康对照组最少；mt-cfDNA 完整性与RCC 恶性转移程度呈负相关。此外，无论是来源于移植瘤小鼠模型还是肿瘤患者血中的mt-cfDNA，其平均片段长度均比健康对照组短，且与肿瘤负荷及cfDNA 浓度呈负相关。因此，mt-cfDNA可作为诊断RCC的重要分子标志物。

2 cfRNA

虽然人类基因组中约70%DNA被转录为RNA，但是非编码RNA 占98%以上。非编码RNA 通过与疾病关联因子的相互作用，在疾病发生发展过程中发挥重要的调控作用。cf-ncRNA 是一种存于人外周血并游离于细胞外的非编码RNA片段，包括循环游离微小RNA（cf-miRNA）、循环游离长链非编码RNA（cf-lncRNA）、循环游离环状RNA（cf-circRNA）等。通常，外周血中的cf-ncRNA 受蛋白质修饰或包裹于囊泡中以免受RNA酶的水解，从而保持稳定的状态。越来越多的研究表明，cf-ncRNA 对RCC 的诊断与预后具有重要的临床意义。

2.1 cf-miRNA miRNA作为一类进化保守的非编码小分子RNA，由单链RNA 前体经Dicer 酶和Drosha酶剪切加工而成，长度为18 ～22 个核苷酸。作为一种反义转录物，miRNA 通过与靶mRNA 3‘UTR的碱基配对而使之受切割，从而在转录水平上实现对靶基因的调控。虽然miRNA 在细胞内并不直接翻译成蛋白质，但其可通过下游效应分子、靶基因之间的相互作用网络调控肿瘤细胞生物学行为。

研究发现，cf-miRNA可作为RCC的潜在诊断标志物。Lou 等研究发现，cf-miR-144-3p 在ccRCC 患者外周血中显著上调，尤其在晚期pT 期，是一种较好的诊断ccRCC 的血生物标志物。Wang 等发现，在术后第7 天ccRCC 患者的外周血中cf-miR-483-5p水平增加。同时，cf-miR-483-5p 的高表达与肿瘤的低分期呈正相关，然而与中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）和淋巴细胞与单核细胞比率（LMR）呈负相关；cf-miR-483-5p 的过度表达可导致上皮-间充质转化（EMT）过程的逆转，抑制RCC细胞的增殖和转移。因此，miR-483-5p 的表达与炎症状态呈负相关，可能是ccRCC 的一个潜在的外周血生物标志物。除了上述几种cf-miRNA，miR-210、miR-211、miR-1233 和miR-429 均被证明可作为RCC 的诊断因子。多种cfmiRNA 联合诊断RCC 比单种具有更高的诊断准确性。Redova 等发现，相比于正常健康人群，RCC 患者外周血中cf-miR-378 上调，cf-miR-451 下调，cfmiR-378 和cf-miR-451 的ROC曲线下的面积（AUC）分别为0.71 与0.77；若将两者联合诊断AUC为0.86，高于任何一种cf-miRNA 的诊断准确性。

此外，cf-miRNAs 与RCC 患者生存率、预后效果及临床分期均密切相关。Tusong 等发现，RCC 患者外周血中的cf-miR-21、cf-miR-106a 水平均高于健康对照组，但在肾切除术后1 个月，两者表达水平均显著降低，这提示cf-miR-21、cf-miR-106a 水平与RCC负荷具有相关性，可作为RCC预后的潜在分子标志物。Fedorko等也认为血cf-miR-378、cf-miR-210可能成为诊断RCC 术后预后效果的分子标志物。此外，还发现miR-378 水平升高与无病生存期及临床分期呈正相关。Chanudet 等发现，Ⅲ和Ⅳ期的晚期ccRCC 患者cf-miRNA 表达谱与健康对照组或处于早期的ccRCC患者间存在较大差异，这提示cf-miRNAs 可能为诊断RCC 的进展提供一些依据。

2.2 cf-lncRNA lncRNA作为一种长度超过200 个核苷酸的RNA分子，虽然不直接编码蛋白来调控细胞功能，但可通过多种不同机制来调控基因表达和蛋白合成。近年研究认为，lncRNAs 可作为致癌或抑癌因子调节肿瘤的发生和进展，以lncRNAs 为靶点的肿瘤治疗研究目前正陆续开展。

lncRNAs 的表达具有组织特异性，且其特殊结构使得其在外周血中不易被降解而相对稳定存在。虽cf-lncRNA 作为肿瘤的分子标志物及其调控机制已有较多研究报道，但与RCC 关联报道较少。lncRNA GIHCG作为一种最早在肝细胞癌中被发现的 lncRNA，其可通过招募转录因子 EZH2 和DNMT1 到miR-200b/a/429 启动子并与之结合，可从表观遗传层面抑制miR-200b/a/429 表达，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移过程。He 等发现，与癌旁组织相比，lncRNA GIHCG 在RCC 组织或外周血中均处于高表达状态，并与患者的TNM分期、Fuhrman 分级及预后不良呈正相关。因此，以血cflncRNA GIHCG 水平区分RCC 和健康人群准确性较好（敏感性为87%，特异性为84.8%，AUC=0.920）。此外，在RCC根治术后患者血cf-lncRNA GIHCG 水平也随之降低，证实外周血的cf-lncRNA GIHCG 可能来源于RCC 组织；通过细胞功能实验发现，GIHCG 基因敲除后RCC 细胞的增殖和迁移受到显著抑制。因此，认为cf-lncRNA GIHCG 可用于RCC诊断、预后及药物靶点。

lncRNA 可通过靶向miRNA 来调控细胞功能。lncPANDAR 作为原癌性因子，已被证实与RCC 的预后呈负相关，与下游的miR-1204 和miR-1207 功能抑制相关。lncRNA-LET 被认为是可以抑制多种肿瘤发生的一种抑癌因子，其机制是通过靶向miR-373-3p 来调节Wnt 信号拮抗剂Dickkopf 1 和组织金属蛋白酶抑制物-2（TIMP-2）的表达，从而扰乱线粒体膜电位，诱导细胞发生凋亡。lncRNA 也会通过与靶基因竞争miRNA的结合位点，对靶基因的表达以及功能发挥产生影响。由于lncRNA PTENP1与PTEN 的3’非编码区具有高度同源性，PTENP1扮演了竞争性内源RNA（ceRNA）的角色，与PTEN竞争性靶向结合miR-21，调节PTEN 基因介导的RCC 细胞的增殖、迁移和侵袭过程。相类似的是，lncRNA PVT1 可作为ceRNA 招募miR-200s，调控ZEB1、ZEB2 和BMI1 的表达，从而影响RCC 细胞的增殖、迁移和侵袭过程。

lncRNA 还可作为RCC 耐药的预测指标。通常，RCC 耐药性是其临床治疗中的主要难题。Qu 等发现，RCC细胞株对舒尼替尼产生耐药后，lncARSR表达水平明显增加。与正常对照人群相比，RCC 患者血清中cf-lncARSR 显著性增加；患者行RCC 手术治疗后其cf-lncARSR 水平发生下调，然而在肿瘤复发时又发生上调。因此，血cf-lncARSR 可以作为预测患者用药后PFS 的独立指标。分子机制研究发现，lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449，促进RCC 细胞内AXL 和c-MET 表达，并进一步激活下游STAT3、AKT 和ERK 信号通路，导致RCC 对舒尼替尼产生耐药性，此外，具有生物活性的lncARSR可以整合到外泌体中，将舒尼替尼耐药性传递到临近肿瘤细胞或其他部位内的敏感RCC 细胞。相反，以lncARSR、AXL或c-MET为靶点的核酸疗法可以恢复耐药细胞株对舒尼替尼的应答。上述研究证实lncARSR 与RCC 耐药相关，有可能作为RCC 靶向用药疗效的预测因子。

2.3 cf-circRNA circRNA 作为一种闭合环状结构的RNA，与miRNAs 和lncRNAs 类似，也是一类非编码RNAs。但与线性RNAs 不同的是，circRNAs 无5’与3’端，其形成一个闭合连续环，这种特殊结构使得其较线性RNA更加稳定，以免受血液RNA酶的降解。circRNA 通过结合肿瘤关联的miRNA，发挥其竞争性内源RNA 的调控机制，充当“海绵”功能，进而影响miRNA对其靶基因的调节作用，调控肿瘤细胞功能。Ma 等在分析RNA 微阵列数据时发现，相比于癌旁组织，RCC 组织中共有324 个circRNA 下调，218 个circRNA上调，以此为基础构建了一个circRNA-miRNA-mRNA 相互作用网络。Xiao 等在研究中发现，RCC 患者外周血囊泡或肿瘤组织中，其circ-400068 的水平均高于健康对照组。体外机制研究证实，circ-400068 通过调控下游分子miR-210-5p/SOCS1 轴促进RCC细胞的增殖并抑制其凋亡过程，这提示circ-400068 可以作为RCC 治疗的新靶点。Huang等在研究中发现，circABCB10 在RCC肿瘤组织中显著高于其癌旁组织。同时，5 种RCC 细胞株（ACHN、Hs891.T、A498、Caki-2 和Cal-54 细胞）circRNA水平均高于正常肾小管上皮细胞株（HREC细胞）。circ-ABCB10 的表达与晚期病理分级和肿瘤淋巴结转移分期呈正相关，与RCC 患者预后呈负相关。此外，HHLA2、Hsa-circ-0001451 和circPCNXL2均可作为预测RCC 预后的核酸标志物。

2.4 循环游离YRNA YRNA 作为一种新型的非编码RNA 分子，由RNA 聚合酶III 转录而成，具有与其互补的5’和3’UTRs 形成特征性的茎环结构，序列具有高度保守性。YRNA包括YRNA1、YRNA3、YRNA4 和YRNA5 四种不同的转录本。通常情况下，YRNA分子与小RNA结合核酸外切酶保护因子SSB 或者Ro60s 结合，使其在转运过程中保持稳定，不受核酸酶所降解。

YRNA 在多种肿瘤中呈高表达，若YRNA1 或YRNA3 表达受到抑制，将导致细胞增殖能力下调。Nientiedt 等发现，相对于正常肾组织，RCC 组织中YRNA3 和YRNA4 表达显著增加，且YRNA4 表达量与进展期RCC 及淋巴结转移均呈负相关关系，但尚未发现两者在RCC 患者和正常健康人群外周血表达水平的差异。因此，cf-YRNA 对RCC 的诊治价值尚需深入研究。

2.5 循环游离Piwi 蛋白相互作用RNA piRNA 是近年来新发现的一类非编码小RNA分子，最初发现时认为piRNA 主要参与维持遗传物质的稳定性。但最新研究表明，piRNA 参与调控肿瘤抑制基因的甲基化，促进细胞发生“干细胞化”改变，从而促进肿瘤的发生和发展进程。

有研究证实，piRNA 的异常表达与多种癌细胞增殖、分化、进展和转移形成有关，这提示其在肿瘤形成中扮演重要角色。Ren 等检测了6 对RCC 组织及配对的癌旁组织的piRNA 水平，发现有19 个piRNA表达异常，其中piRNA-31115 在RCC组织的表达量显著高于癌旁组织。此外，细胞实验发现piRNA-31115 在Caki-1 及786-O细胞均呈高表达，若通过特异性抑制剂下调piRNA-31115 的表达，则细胞增殖能力受显著性抑制。因此，认为piRNA-31115可能是RCC 治疗的分子靶点。此外，piR-32051、piR-39894、piR-43607、piR-30924 和piR-38756 的高表达与其转移和预后均呈负相关。Iliev 等发现在RCC组织中piR-823 水平与患者的无疾病生存期呈负相关；RCC 患者血清中cf-piR-823 水平高于健康对照组，且与RCC 晚期分期呈正相关，这提示piR-823 可作为预测RCC 患者预后的潜在标志物。

3总结与展望

CNAs在肿瘤发生发展的进程中扮演重要作用，已成为当前医学研究的热点。CNAs 所具有的高稳定性及组织特异性等特征，使其有望成为RCC 诊断与预后的分子标志物。然而，CNAs 在常规临床检验的应用并不多，需要进一步进行临床转化。未来，关于CNAs 的研究仍有许多值得探索的方向：（1）建立RCC CNAs 表达谱，深入研究其与人群、种族之间的相关性；（2）设立统一的样本采集、检测及数据分析的质控标准；（3）开发CNAs标志物联合的检测，以提高诊断准确性与操作便捷性；（4）探索除血液外其他更易获得的体液样本（如尿液、唾液以及汗液等）用于诊治RCC 的可能性。随着肿瘤分子诊断的快速发展，CNAs 将会给RCC 患者的诊治带来新希望。

(参考文献略，读者需要可向编辑部索取)