陈铮铮，吕火烊

作者单位： 310014 杭州，浙江省人民医院

生物芯片技术是对生命体海量信息进行检测和分析的重要手段，生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片等。生物芯片虽在生物医学领域的检测、分析和研究中发挥了重要的作用，但仍存在较多不足。液相芯片技术因其所有反应都在液相中完成，是集微球编码技术、液流控制技术、激光技术、生物技术及数字信号处理技术为一体的新型生物分子检测技术。相比传统固相生物芯片，液相芯片将固相平板载体替换为编码微球，每个微球都携带一种可识别的编码信息，以鉴别固定在其表面的探针。一旦微球表面探针种类被识别，探针所捕获的靶分子就能被定性或定量分析，以实现高通量检测，液相芯片技术是最适宜的高通量多指标检测技术之一，本文拟对液相芯片技术的发展以及在检验医学中的应用做一综述。

1 液相芯片技术的发展

液相芯片又称悬浮芯片，最早是1997 年美国Luminex 公司开发研制的多功能分析平台，其所有反应都在液相中完成，有机地整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术及计算机运算法则等多项最新科技成果，在同一平台上即可完成蛋白质和核酸的检测等。液相芯片技术在保持高通量检测的同时，将反应体系由液相－固相反应改变为接近生物系统内部环境的拟液相反应体系，有效确保了生物分子间的特异性反应，发生在正确的高级结构之上，大大提高了生物分子反应效率，缩短了检测时间。通过不同染色功能化微球，快速对一个样本进行多重检测和分析。

在此基础上Luminex 公司已研发出多种商品化的微球以供用于免疫和分子检测试剂的开发。最初的xMAP 微球根据内部两种荧光染料的光谱特征进行区分，可提供100 种光谱不同的微阵列，进一步使用3 种荧光染料将微阵列扩增至500 种。根据应用场景的不同，开发出了系列微球，如直径5.6m 的未包被Microplex裸球为聚苯乙烯微球，携带羧基可共价结合捕获分子，提供500 种不同的颜色组合。LumAvidin微球表面包被抗生物素蛋白，能够结合生物素化的捕获试剂，使待测分子因生物素和生物素蛋白间隔远离微球表面，反应空间更加舒展。SeroMAP 是针对血清学检测中出现的高背景而专门研发的微球，羧基化的微球可提供100 种不同的颜色组合，可减少非特异性的结合。MagPlex 是直径为5.6m 的超顺磁性微球，表面具有羧基功能基团，可提供500 种不同颜色的组合，可通过磁力作用与溶液分离，易于自动化和洗涤。

在不同荧光编码的微球上可进行抗原、抗体、酶、底物、配体、受体的结合反应及核酸杂交反应。通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100 种不同的生物学反应。迄今为止，全球已有数百套基于xMAP技术的检测试剂用于免疫学、蛋白质、核酸检测及基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，是最早通过美国食品与药品管理局（FDA）认证的用于临床诊断的生物芯片技术，并逐渐成为一种高通量代表性技术。美国Applied Bio Code Inc 公司又提出了一种全新的数码液相芯片技术，采取数码磁珠作为编码元素，将顺磁性材料掺入具有生物兼容性的高分子聚合物内，通过光刻法将12 位二进制的数字条码刻到磁珠上，通过这种工艺制备得到4 096 种不同编码的数码磁珠，将蛋白、抗体或核酸分子偶联在特定的磁珠上，通过特定的数码液相芯片检测仪器精准识别数码磁珠上的数字条码信号，进而实现高通量多指标的检测。通过光刻法制备的数码磁珠，其批间差小，且具有极稳定的表面化学特性，同时数码磁珠上的条形码图案可以提供强对比度的信号，保证使用数码液相芯片技术得到更加精准且稳定的检测结果。

2 液相芯片技术的特点与优势

2.1 高通量 可对同一样本中的多种不同待测分子同时进行实时、定性、定量分析。在不存在交叉反应的情况下，检测的通量等于编码微球的种类数，理论上最多可达到上百甚至上千种，可以真正实现高通量、多指标的快速检测。

2.2 样本用量少 由于在同一个反应孔中可以同时完成几十种不同的生物学反应，大大节省了样本用量，少至0.1l 的样本即可检测，非常适合分析微小体积尤其是稀有样品。

2.3 操作简单、快速 由于是基于液相反应动力学，反应速度快，孵育时间大为缩短。免疫学分析可在1 ～2 h内完成检测，核酸杂交分析在聚合酶链式反应（PCR）扩增后1 h 内可得到结果。不需要洗涤即可直接读数，计算机分析处理系统的信号转换能力强，可迅速得出统计结果，约1 h内即可完成96 个样品的检测，给出9 600 个数据，检测效率大为提高。

2.4 灵敏度高 液相反应环境有利于保持蛋白质等的天然结构，有利于探针和检测物之间的反应。微球表面积大，每个微球上可包被105～106个捕获抗体，高密度的捕获抗体保证了最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度，最低检测浓度可达0.1pg/ml。

2.5 检测范围广 可达3 ～5 个数量级，且样品无需浓缩或稀释。

2.6 特异性强 无需洗涤即可将与微球结合的和未结合的分子区分开来，只读取单个微球上的荧光信号，信噪比好。两束激光分别分析微球上的荧光和待测分子上报告分子的荧光，并且激光只分析一定半径微球上的信号，检测特异性强，背景信号低。

2.7 准确性高 采用荧光区分荧光编码微球，每个微球都可高密度的共价结合探针分子，产生的信号强，微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子呈正比，且液相芯片技术的检测范围广而减小误差。

2.8 重复性好 液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏，因每种微球检测100 个，取荧光强度中值作为结果，相当于对每个样本重复检测了100次，检测结果的准确性和重复性大为提高。

2.9 成本低 同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本，同时提高分析效率，还可随检测指标的增加进一步降低费用。

2.10 灵活性好 微球表面可以包被各种特异性探针，如抗原、抗体、寡核苷酸、酶底物或者受体，应用于免疫测定、酶学检验等分子生物学研究的多个方面，商品化试剂盒的使用者只需增减探针交联微球和标记分子即可满足不同检测项目的需要。可应用于分子诊断、免疫诊断、伴随诊断、个体化医疗及生命科学研究等。

3 国内液相芯片技术发展的现状

由于具有高性能的荧光编码微球制备过程复杂、涉及到多学科交叉、技术门槛很高，属于体外诊断领域最为高精尖技术之一，国际上基本被Luminex 所垄断。早期以美国Luminex 为代表的国外液相芯片技术以专利授权或合作形式进入中国，国内液相生物芯片技术起步较晚，其中较为出名的是上海透景生命科技股份有限公司，作为国内最早和Luminex授权与合作的公司，现已推出了多肿瘤标志物、人乳头瘤病毒（HPV）的联检测试剂盒、优生优育试剂盒等。

另一些国内公司以新的技术路线，在多维编码微球及荧光信号智能采集处理等方面进行创新，逐渐打破国外公司的技术壁垒，建立起中国自主知识产权的液相生物芯片技术体系。另外，研究者根据研究需要自行制备探针微球交联微球，建立反应体系对各种标本进行检测。

虽然以美国Luminex 成为液相芯片技术的代表，也是最适宜的高通量、多指标生物检测技术发展方向之一，但仍然存在制约其发展的瓶颈。如编码微球在制备时，将具有不同特性的荧光材料同时装载在微球内部或者表面，几种不同荧光特性的材料相互靠近会发生相互作用甚至干扰，从而影响编码的精准性。由于微球空间的限制以及将荧光元素同时装载在微球内部或者表面的方式，必须采用装载特性相互兼容的荧光材料，限制了可用于编码的荧光材料的选择范围与编码容量。中翰盛泰生物技术股份有限公司与上海交通大学生物医学工程学院在液相芯片技术上提出了“基于主客体结构的新型光学编码微球新策略”，包含主体球和客体球两个组成单元，每个组成单元都含有特定的编码元素。以微米级颗粒为主体球，以纳米颗粒为客体球，通过化学共价方式将大量客体荧光子球牢固结合至单个主体母球表面，获得表面具有多级微纳结构的主-客体复合微球。通过改变主、客体球的种类和不同客体球的配比，对复合微球的荧光特性进行精确调控。主、客体球中的编码元素可以是有机染料、金属化合物、量子点等多类新型荧光元素。这种新型编码微球能有效避免不同荧光编码元素之间的相互干扰。此外，不同主、客体球可以分别合成，将扩大荧光编码元素的选择范围，依据荧光编码元素本身特点在最合适的条件下进行单独制备，并且具有多级微纳拓扑结构的复合微球相对于传统光滑表面的微球具有更大的比表面积，为待测靶分子的固定提供更多结合位点，提高多指标检测的性能，并已经成功实现产业化。

4 液相芯片技术在检验医学中的应用

4.1 细胞因子检测方面的应用 同时检测多种细胞因子可以全面判断机体免疫功能，在疾病诊断、病程观察及疗效评价方面有重要意义，还能用于研究发病机制与药物作用机制。

4.2 肿瘤标志物检测方面的应用 肿瘤标志物是反映肿瘤存在的生物标志物，其存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化及细胞功能，采用液相芯片技术检测肺癌、妇科肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌及宫颈癌中相关的癌基因，经多项研究与化学发光法相比具有良好的相关性。

4.3 病原体检测方面的应用 如采用液相芯片快速检测结核耐药基因和常见细菌大环内酯类和-内酰胺酶类耐药基因，检测幽门螺杆菌相关蛋白基因与临床常见细菌大环内酯类和 内酰胺酶类耐药基因，检测乙型肝炎DNA、抗体和HBV 变异株，分别从蛋白质和核酸水平对乙型肝炎病毒进行检测，对HPV病毒感染的疾病进行相关检测，为预防宫颈癌的发生提供一种早期诊断依据，设计针对禽流感病毒H5N1 亚型的检测方法等。

4.4 基因检测方面的应用 只需在扩增基础上，对扩增产物采用液相芯片进行分析即可，实验简单、易掌握、结果稳定可靠。如采用液相芯片技术检测非小细胞肺癌患者的EGFR 基因突变，还可从男性不育、食管鳞癌、非小细胞癌及尖锐湿疣等方面采用液相芯片技术对相关基因突变进行研究，采用液相芯片技术研究PCR-LDR 对KRAS 基因分型的关系，采用液相芯片法检测人HLA 相关基因从而为肾移植术后监测提供了依据，采用液相芯片检测了青年女性胃癌组织和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA 的水平等。

除上述应用以外，液相芯片技术还可用于激素、炎症因子中医症型、中枢神经系统性疾病、自身抗体、研究酶/底物与分析蛋白表达等方面。

5 液相芯片技术的发展趋势与展望

鉴于液相芯片技术在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模分析中具有巨大的应用潜力，还可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体-配体识别分析蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质核酸相互作用分析等众多领域的研究。随着数字化技术的发展，数据处理系统的升级与数据处理能力的提升，以及检测流程自动化水平的提高，并随着人类对生命现象的认识不断深入，对疾病检测不再仅仅依赖于单一指标进行诊断，而是将人体作为一个完整的系统，利用多种指标的组合对疾病的发生、发展及预后进行更加精准的检测、判断以及治疗指导。作为最适宜多指标同时检测的技术，将会在“遏制疾病，诊断先行”得到更广发的推广和使用，除了将在检测医学中发挥作用，还将会在医学基础研究、新药开发、司法鉴定和食品卫生监督等领域展现出广阔的应用前景。