唐超 蔡琳 张艺文 汪汉

(西南交通大学附属医院 成都市第三人民医院心内科 成都市心血管病研究所，四川 成都 610031)

2019年底开始，新型冠状病毒肺炎从湖北武汉迅速传播到中国各省及全球，严重危害到了人类健康。本次由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引发的疾病被世界卫生组织命名为2019冠状病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。2019-nCoV与引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)的冠状病毒关系密切，同为β属冠状病毒，并且具有相同的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受体[1]。COVID-19在流行病学上表现为潜伏期长、传染性强和人群普遍易感的特点，从中医观点看，归于“疫病”范畴。患者感染2019-nCoV后不仅有发热、乏力和干咳等典型的临床表现，还有与病毒感染相关的心脏受损的症状，其中，心肌炎是COVID-19患者心脏受损的重要表现之一[2]，其可能的发病机制为全身炎症反应。而血必清注射液具有补脾益气和清热解毒的功效，临床上用于治疗因呼吸系统疾病和泌尿系统疾病等感染引起的全身炎性反应综合征，对因感染、创伤和烧伤等引起的多器官功能障碍综合征(瘀毒互结和热毒内陷证)患者的器官功能受损期和衰竭早期也有一定作用，推测血必清注射液可能是2019-nCoV感染合并心肌炎的一种潜在治疗药物[3]。

血必清注射液是红花、赤芍、川芎、丹参和当归等中药材提取物，主要成分为红花黄色素A等，用于温热类疾病，症见发热、喘促、心悸和烦躁等瘀毒互结证，适用于因感染诱发的全身炎症反应综合征，也可配合治疗多器官功能失常综合征的脏器功能受损，但其作用机制尚不明确[4]。在治疗2019-nCoV感染的处方中，血必清注射液是新冠2号和新冠3号的推荐中成药[5]。因中药所含有效成分复杂，仅通过实验对其作用机制进行全面研究较为困难，而网络药理学则融合了药理学、系统生物学、计算机生物学及网络分析等多学科的技术和内容，通过构建“药物-活性成分-靶标-疾病”多层网络来分析药物作用于疾病的机制。本研究基于网络药理学方法，对血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的作用机制进行系统分析，为血必清注射液的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，UniProt数据库(UniProt，https：//www.uniprot.org/),GeneCards数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org),OMIM数据库(OMIM，https：//www.omim.org),Cytoscape 3.6.1软件(Cytoscape，https：//cytoscape.org),STRING数据库(String，https：//string-db.org/)和R 3.6.2软件(R，https：//www.r-project.org)。

1.2 药物活性成分及靶点

TCMSP可提供中药主要成分、靶点和疾病的信息，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug likeness，DL)是筛选药物主要成分常用的参数。借助TCMSP数据库分别检索血必清注射液的主要组成成分：红花、赤芍、川芎、丹参和当归，筛选出OB≥30%和DL≥0.18的化合物作为血必清注射液的主要成分，并根据TCMSP数据库中的“related targets”功能，筛选出与其化合物相对应的靶点。此外，利用UniProt数据库把靶点蛋白名称统一转化为基因名称，删除部分不规范的靶点。

1.3 疾病靶点的预测

GeneCards数据库收录了较全面的人类基因信息，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和遗传学等。OMIM数据库主要对人类基因和表型及其之间的关系进行了全面描述。在GeneCards数据库和OMIM数据库中分别检索2019-nCoV和心肌炎，然后把两个数据库的检索内容合并取交集，交集所得结果即2019-nCoV感染合并心肌炎的相关靶点。

1.4 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶点预测

药物和疾病的共同靶点即药物作用于疾病的潜在靶点。通过使用R软件中的“VennDiagram”安装包对血必清注射液和2019-nCoV感染合并心肌炎的靶点取交集，两者的共同靶点即血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相关靶点。

1.5 可视化网络构建及关键靶点筛选

蛋白互作网络和“药物-活性成分-靶点-疾病”网络能更明确地显示药物和疾病之间复杂的相互关系。药物的活性成分可直接或间接作用于疾病靶点从而发挥治疗作用，而疾病的形成和治疗与其靶点也有着直接或间接的关系。血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相关靶点输入STRING数据库来构建蛋白互作网络，物种设置为“人”(“Homo sapiens”)。根据靶点蛋白相互作用连线数目进行排序，连线数目越大表示该靶点蛋白在药物治疗疾病过程中所起作用越大，选用蛋白互作网络中连线数目最多的30个靶点蛋白作为关键靶点。利用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。网络主要包括药物、药物活性成分、疾病及其靶点四类节点，两节点之间均以边相连。

1.6 基因本体及通路富集分析

基因本体(gene ontology，GO)富集分析常用于注释基因及其基因产物的功能，包括分子功能、生物过程和细胞组分三个生物学范畴。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)可对靶点进行通路富集分析，有利于探索药物治疗疾病的作用机制。利用R软件的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”安装包对血必清注射液治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并以P<0.05作为筛选条件，将前20条富集显著的结果进行图表可视化。

2 结果

2.1 血必清注射液的活性成分及靶点

利用TCMSP数据库分别检索血必清注射液的主要组成成分：红花、赤芍、川芎、丹参和当归，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，删除无相对应靶点的化合物、重复或无相对应基因名称的靶点蛋白，最终获得125个符合条件的有效成分(红花22个，赤芍29个，川芎7个，丹参65个，当归2个)，其对应6 933个相关靶点(红花1 466个，赤芍681个，川芎1 356个，丹参2 566个，当归864个)，共215个靶基因。

2.2 2019-nCoV感染合并心肌炎的靶点

利用GeneCards数据库和OMIM数据库分别检索COVID-19和心肌炎，并把两个数据库的检索结果合并，获得COVID-19相关基因359个，心肌炎相关基因1 062个，然后把以上两种疾病的相关基因取交集，最终获得2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因177个。

2.3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相关靶点及“药物-活性成分-靶点-疾病”网络构建

对215个血必清注射液的靶基因和177个2019-nCoV感染合并心肌炎的相关基因进行Venn分析，获得41个疾病和药物的共同基因，即为血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的潜在靶点，其对应血必清注射液化合物71个。将疾病、药物以及筛选得到的药物活性成分、疾病和药物的共同靶点导入Cytoscape软件进行“药物-活性成分-靶点-疾病”网络的构建，见图1。网络中共有78个节点(35个化合物、41个靶点、1个疾病和1个药物)，235条边，不同形状(或不同颜色)的节点分别代表药物、药物活性成分、靶点和疾病。

注：长方形节点：血必清注射液活性成分；圆形节点：疾病-药物的共同靶点。图1 药物-活性成分-靶点-疾病网络图

2.4 蛋白互作网络的构建及关键靶点筛选

通过将疾病和药物的共同靶点导入STRING数据库，设定物种为人，并隐藏蛋白互作得分<0.4的边，构建蛋白互作网络，发现网络中有41个相互作用节点，496个边，结果见图2。网络中各节点代表不同的靶点蛋白，不同颜色的边代表不同的相互作用类型，靶点蛋白间相互作用连线的数目与该靶点在药物治疗疾病过程中所起作用相关。按照相互作用连线的数目大小进行排序，选用连线数目最多的30个靶点蛋白作为关键靶点，包括白介素(IL)-6、IL-10、白蛋白(ALB)、C-X-C基序趋化因子8(CXCL8)、IL-1β、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、胱天蛋白酶3(CASP3)、趋化因子2(CCL2)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、胱天蛋白酶8(CASP8)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、转录因子(RELA)、原癌基因(FOS)、IL-2、过氧化氢酶(CAT)、表皮生长因子受体(EGFR)、信号转导与转录因子1-α/β(STAT1)、血红素加氧酶1(HMOX1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、纤溶酶原激活物抑制物1(SERPINE1)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、C反应蛋白(CRP)、雌激素受体1(ESR1)、CD40配体(CD40LG)和干扰素调节因子1(IRF1)，并将上述靶点蛋白做出柱状图，见图3。

注：节点：靶点蛋白；不同颜色的边：不同的相互作用类型。图2 血必清注射液治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的蛋白互作网络图

注：横坐标：相互作用连线的数目；纵坐标：靶点蛋白。图3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的关键靶点

2.5 GO及KEGG富集分析

利用R软件对血必清注射液治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的相关基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，两者均以P<0.05作为筛选条件，P值越小富集越显著，在其功能或通路上的基因越多。在GO富集分析中含有71个生物学过程，根据P值大小进行排序，选取富集前20位的生物学过程，见表1。表1显示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎，主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、磷酸酶结合和趋化因子受体结合等多种生物学过程。KEGG富集通路发现，41个疾病-药物共同靶点显著富集在135条通路上，其中前20条富集显著通路的具体信息见图4。纵轴为通路名称，横轴为基因比值。基因比值的大小表示富集程度的高低，点的大小表示富集的靶点基因数量，点的颜色从红色到蓝色表示P值从小到大。血必清注射液在治疗2019-nCoV感染合并心肌炎中主要通过糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、Chagas病和甲型流感等疾病相关通路发挥作用。

3 讨论

随着计算机信息学的迅速发展，网络药理学为研究中药的多成分及复杂的作用机制提供了新的研究方法。网络药理学从整体考虑药物与疾病的相关性，强调药物、靶点与疾病间相互作用的系统性，反映中成药的多成分、多靶点和多通路的作用特点[6]。因此，本研究首先使用TCMSP数据库对血必清注射液的中药活性成分进行筛选；运用GeneCards数据库和OMIM数据库对疾病靶点进行预测筛选，构建活性成分靶点网络图。将得到的靶点利用STRING进行蛋白互作网络构建，并进行GO和KEGG富集分析，构建靶点信号通路网络图，从而发现血必清注射液主要的活性成分、主要作用的靶点和调节的通路。具体发现有：血必清注射液5个最主要的中药活性成分为：红花、赤芍、川芎、丹参和当归。研究结果显示血必清注射液与2019-nCoV感染合并心肌炎的交集靶点共有41个，其对应血必清注射液的活性成分主要包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黄芩素等。研究表明血必清注射液可通过调节免疫功能发挥抗病毒作用，且有明确的抗炎机制，可能作为COVID-19的潜在抑制剂[7]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、调节免疫和保护心肌缺血再灌注损伤等作用。槲皮素可通过抑制核因子κB信号通路减少核因子κB的产生，从而达到抗炎的作用[8]。木犀草素能抑制流感病毒的增殖和炎性细胞因子的表达，影响Toll样受体通路和凋亡相关因子的表达，减轻病毒对宿主细胞的免疫损伤，发挥抗病毒作用[9]。β-谷甾醇对脂多糖致急性肺损伤有一定的保护作用，亦可改善非酒精性脂肪肝患者肝细胞脂肪变性程度，减轻氧化应激反应，从而对肝脏起到保护作用[10]。研究表明，山奈酚具有良好的抗菌活性，对耐甲氧青霉素的金黄色葡萄球菌也有作用，在抗病毒方面，山奈酚在非细胞毒性浓度呈浓度依懒性抑制。黄芩素可减弱炎症反应、氧化应激及肺组织细胞凋亡，可能通过抑制p38 MAPK通路发挥对肺组织的保护作用[11]；同时可抑制新生血管形成，通过降低血压和扩张血管等方式发挥保护心脑血管的作用；亦可直接清除活性氧，减轻缺血再灌注心肌细胞氧化应激反应，提高心肌细胞的生物功能和存活率[12]。

表1 血必清注射液治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的主要生物学过程(前20个)

通过蛋白互作网络分析筛选出血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的关键靶点，包括IL-6、IL-10、ALB、CXCL8和IL-1β等，分析发现这些靶点主要与炎症反应、免疫调控以及细胞的增殖、分化和凋亡等密切相关。IL-6和IL-10在炎症反应中起重要作用，能参与免疫反应的细胞增殖和分化[13]。研究表明宿主细胞可通过蛋白的泛素化修饰抑制MAPK/ERK通路，从而抑制病毒感染[14]。

GO和KEGG富集结果表明血必清注射液通过多种生物学过程和多条信号通路参与2019-nCoV感染合并心肌炎的治疗过程。从GO富集分析结果可得知，共同靶点主要涉及生物学过程有细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、磷酸酶结合和趋化因子受体结合等。KEGG通路富集分析结果显示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶点主要涉及糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、Toll样受体信号通路及多种疾病等多条通路。其中，糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路已被证实与2019-nCoV感染相关[15]。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路与血管损伤、炎症反应和动脉粥样硬化密切相关，通路激活可导致活性氧过量产生，核因子κB活化，黏附因子和细胞因子表达增加[16]。TNF信号通路和IL-17信号通路均能调控细胞凋亡，是炎症反应过程中重要的通路。Toll样受体信号通路是免疫反应过程中的重要通路，三萜类化合物可通过Toll样受体信号通路减轻脂多糖引起的心肌功能障碍[17]。由此推测，血必清注射液是通过抑制炎症反应，调节免疫功能和调控细胞凋亡来治疗2019-nCoV感染合并心肌炎。

图4 血必清注射液治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的主要通路(前20条)

综上所述，本研究基于网络药理学的方法探讨了血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的活性成分及可能的作用机制，结果显示血必清注射液的主要活性成分为槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黄芩素，其主要通过调节IL-6、IL-10、ALB、CXCL8、IL-1β、MAPK8和CASP3等靶点，调控AGE-RAGE、IL-17和TNF等信号通路来抑制炎症反应，调节免疫功能和调控细胞凋亡，从而达到治疗2019-nCoV感染合并心肌炎的目的。本研究仍存在一定的局限性，如网络药理学基于数据进行的研究，有关疾病和药物的资料收集的结果可能不全面，以及通过数据库筛选出的中药活性成分可能与实际吸收进入人体循环的药物成分有差异。因此仍需进一步的实验来验证本研究结果。