于博文 修成奎 王雪 杨静 雷燕

(1.中国中医科学院医学实验中心 北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京 100700； 2.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700)

细胞间通讯包括细胞间直接接触和细胞外分泌，近年来，以内皮微粒(endothelial microparticles，EMP)为媒介的细胞间通讯日益受到关注。EMP由内皮细胞产生，能通过多种方式影响受体细胞的功能。鉴于这种调节细胞功能的潜力，学者们认为EMP可作为内皮功能障碍和血管健康的生物标志物，也可预测多种疾病并判断预后。但目前对EMP分子机制的理解还不够深入，在其研究及检测方法上存在局限性。现就近年EMP的研究进展进行综述，为临床诊疗提供一些思考，以期推进EMP作为疾病靶标的转化医学研究。

1 EMP概述

1.1 EMP的概念和病理生理功能

细胞外囊泡是脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，由细胞分泌产生并释放到细胞外环境中，在血液、尿液、乳汁、唾液、精液、关节液或脑脊液中均可被检测到。根据其来源、大小和成分，通常分为外泌体、微粒和凋亡小体。微粒是从激活或损伤的细胞上脱落的微小囊泡，由细胞膜向外出芽形成，直径0.1～1 μm，含胞浆、膜蛋白、RNA和microRNA等。微粒表面具有母体细胞来源的膜磷脂结构和蛋白质成分，并携带有母体细胞源的膜表面分子标志物[1]。1976年，Wolf[2]首次证实来源于活化血小板的血小板微粒，并将其命名为“血小板尘埃”。1999年，Combes等[3]首次发现用肿瘤坏死因子-α刺激脐静脉内皮细胞能促使其释放EMP。迄今为止，血小板、淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌、视网膜、祖细胞和癌细胞等各种类型细胞均被证明可释放微粒，并根据其细胞来源命名为EMP和血小板微粒等[4]。

EMP在生理情况下数量较少，近几年研究发现，这些经常被忽视的EMP正逐渐成为内皮功能失调的潜在指标，是反映内皮损伤的新标志物。EMP可参与细胞间信息传递，具有促凝活性，调节凝血与抗凝系统的平衡，且能介导炎症反应，在血管损伤及生成等过程中也发挥重要的作用[5]。在病理情况下，血管内皮细胞受到外界刺激进后产生的较高水平EMP，可参与各种病理过程，如可通过一氧化氮生物利用度受损，暴露促凝血剂[磷脂酰丝氨酸(PS)或组织因子(TF)]，或转移p38丝裂原活化蛋白激酶，影响内皮的动脉粥样硬化保护功能[6-7]。

1.2 EMP的形成和释放

EMP的形成和释放机制尚不十分清楚，主要依赖于体外培养内皮细胞的研究。除最早发现的肿瘤坏死因子-α外，其他炎性细胞因子[8]、细菌脂多糖[9]、活性氧[10]、纤溶酶原激活物抑制剂[11]、凝血酶[12]以及肿瘤来源的微粒[13]都可导致EMP的产生。另外，物理性刺激如低剪切应力和辐射等也可刺激EMP的释放[14-15]。

目前研究表明，EMP释放到细胞外液的具体过程为：细胞受到上述化学性或物理性刺激后，膜钙通道开放引起钙内流，从而激活钙蛋白酶，触发细胞骨架蛋白(如收缩蛋白和纤维肌动蛋白)的局部降解；同时，膜不对称性丧失，质膜磷脂的不对称分布被改变，使PS被转移到外层而不能用于与收缩蛋白结合[16]；最后，激活的肌动球蛋白系统将囊泡的边缘聚集在一起，以出芽的方式释放EMP[17]。在该过程中，flipase、floppase和scramblase这三种酶的抑制或激活对维持质膜不对称性至关重要[18]。此外，PS的暴露是通过Rho A重组肌动蛋白细胞骨架来调节，Rho的激活是炎症条件下微粒脱落或凋亡的关键因素[19]。

目前对刺激EMP释放的信号转导分子机制研究较少，例如，氯吡格雷可通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶途径抑制硫酸吲哚酚诱导的EMP生成[20]。凝血酶通过依赖于RhoA/ROCKⅡ轴的信号通路诱导EMP释放[12]。在凝血酶激活的内皮细胞中也有TRAIL/Apo2L通路的激活，最终白介素(IL)-1和TRAIL以自分泌或旁分泌的方式，刺激EMP的分泌[21]。

2 EMP在临床中的研究进展及应用

2.1 EMP信使作用表现为促炎、促凝及影响血管生成

EMP信使作用的物质基础是其含有丰富的母体细胞来源的胞膜成分及胞质成分，如表面受体、白细胞分化抗原分子(CD)、PS、TF、细胞因子、脂质及mRNA和microRNA等[5]。EMP可作为“传送器”和“信号体”，通过激活受体和/或直接将微粒内容转移到靶细胞，传递参与细胞黏附、趋化和血管生成的生物活性分子，同时将信息从微粒释放细胞传递给靶细胞，补充了传统的细胞间通讯途径。因此，虽然EMP只代表外周循环中的一小部分细胞微粒，但仍被认为是向周围环境传递重要生物学信息的载体[1]。

然而，目前尚不清楚EMP是否通过旁分泌途径或细胞与EMP的直接接触，从而对其靶细胞产生影响。有研究表明，EMP可通过将蛋白质转移到内皮细胞表面而起作用，EMP还能通过暴露膜结合分子间接影响靶细胞，并最终激活靶细胞受体从而诱导特异性反应[22]；也有研究证实其作用机制类似于吞噬作用，涉及清道夫受体或PS受体[23]。此外，EMP和靶细胞之间的膜融合也可能触发细胞活化[24]。因此，概括EMP靶向效应细胞的机制可能有两种：第一种是通过微粒与膜受体或整合素的相互作用，刺激细胞内信号传导；第二种是通过膜融合或内吞作用，将微粒中的成分“清空”到受体细胞的胞质中。

EMP的信使作用主要表现在促炎、促凝反应以及影响血管生成等方面。研究证实，肿瘤坏死因子-α刺激产生的EMP可作为旁分泌介质，通过上调细胞间黏附分子-1、microRNA的表达和从靶细胞脱落的可溶性细胞间黏附分子-1，诱导内皮细胞发生炎症反应，而非刺激条件下产生的EMP无此作用[25-26]。因此，这种旁分泌效应受EMP产生条件的影响，提示EMP既是炎症反应的原因又是结果。此外，EMP还可作为血管生成的信号，通过激活参与细胞外基质降解和生长因子释放的基质金属蛋白酶，在组织重塑和血管生成中起关键作用[27]。

EMP还可介导促凝，活化细胞产生的EMP在体外可诱导TF依赖性凝血酶形成，在体内则诱导血栓形成，这表现为正常血浆的凝固时间随EMP含量的增加而缩短。由于内皮黏附分子的表达，TF+EMP可与单核细胞等其他细胞结合，从而增强促炎和促凝反应[28]；这种促凝血反应也可能与TF从TF+EMP上转移到活化血小板上有关[29]。此外，EMP富含PS的表面可催化凝血蛋白及其复合物的组装[6]。因此，通过暴露PS和TF，EMP可能作为生物载体在促凝潜能的传播中发挥作用。

2.2 EMP是新的生物标志物及临床预测指标

EMP是内皮功能障碍及血管健康的新的生物标志物。评估内皮功能障碍的传统方法有：多普勒血流检测内皮依赖性血管舒张、静脉闭塞造影、正电子发射断层显像冠状动脉灌注冷加压试验、激光多普勒血流测量和超声等[30]。这些评估方法的缺陷在于具有侵袭性，并且与实际内皮功能相关性差，因此需新的内皮功能替代指标。而揭示EMP在内皮功能障碍中的生物学意义可能预示着血管健康、风险分层和疾病进展的新型无创监测平台的出现。EMP亚群的计数和表型分类与许多疾病中的内皮功能障碍有关。在出现内皮功能障碍的患者中，循环EMP水平与血流介导的扩张幅度呈负相关，与年龄和压力无关[31]。对年轻健康受试者，急性内皮损伤如二手烟会迅速损害内皮功能并增加循环EMP水平[32]。近年来，结合EMP和内皮祖细胞水平的多标志策略作为血管健康的综合标志物也引起了人们的关注。EMP与内皮祖细胞比值的变化可能反映了内皮损伤和修复之间的不平衡，这可能有助于鉴别血管损伤[33]。

EMP还可作为多种疾病的生物标志物及预测指标，在冠状动脉疾病、心肌梗死、血栓、慢性心力衰竭、肺动脉高压、卒中、高血压、糖尿病以及肾衰竭等多种疾病中，EMP被视为各病理过程正在进展或过度激活的潜在生物标志物[34]。目前心血管危险分层使用的非特异性指标，如Framingham危险评分、脑钠肽和高敏C反应蛋白，在预测冠心病高危稳定患者心血管并发症的发生方面是不够的。Nozaki等[35]报道血浆EMP水平可独立预测冠心病高危患者未来心血管事件，用EMP评估内皮功能障碍的多种生物标志物策略可识别易患心血管疾病的人群。此外，在无症状个体中，循环EMP与动脉粥样硬化血栓形成风险增加相关，因此可能提供潜在的预测价值[36]。

2.3 EMP用于判断预后

部分研究也探讨了血浆EMP水平的预后判断潜力。在转移性乳腺癌患者中，化疗后循环EMP水平的降低与更好的总体生存率和无病生存率相关，并且可能作为血管生成相关的预后指标，效果优于血管内皮生长因子A水平[37]。在冠心病高风险受试者中，表达血管内皮钙黏蛋白的EMP基线水平可判断预后，并且与Framingham危险评分、C反应蛋白和脑钠肽水平无关[38]。在慢性肾功能衰竭中也有类似的发现，其中高水平CD31+CD41-EMP是心源性死亡的独立预测因子，而其他血浆微粒亚群则无预后判断价值[39]。综上，EMP在内皮功能、多种疾病及预后中均可作为一种评价和预测指标。

2.4 EMP在临床治疗中的价值

EMP评价可为有症状和无症状患者的临床治疗提供一定的参考，监测导致EMP形成的过程可能与控制疾病进展有关，靶向EMP的治疗手段可能是一项新的挑战。研究表明，黄连素可通过减少循环CD31+/CD42-EMP介导的血管内皮氧化应激，改善内皮功能[40]。抗氧化剂(如维生素C)可改善糖尿病患者和心肌梗死后血脂异常患者的循环EMP水平[41]。他汀类药物对EMP释放也有影响，但仍存在争议：一方面，临床相关浓度的他汀类药物可通过抑制异戊烯化作用，刺激内皮细胞分离和EMP释放；另一方面，他汀类药物可能对内皮细胞具有抗炎作用，抑制Rho激酶途径，导致EMP释放减少[42]。循环缺氧相关疾病(CHRD)，如急性冠脉综合征、卒中和器官移植，与EMP也密切相关。EMP有助于CHRD表型的识别和疾病严重程度的分层，改善CHRD发生的危险分层及CHRD患者的预后[21]。Francois等[43]报道，限制碳水化合物可减少循环EMP，有效缓解餐后高血糖，并改善2型糖尿病患者的内皮功能。此外，微粒作为治疗糖尿病相关心脏、肾脏、周围神经和视网膜损伤的靶点，也显示出巨大的前景。药物控制细胞膜磷脂部分及微粒脱落过程可能有助于控制糖尿病肾病和血管老化[44]。

3 EMP的双面作用

目前研究主要集中在病理状态下的EMP上，因此EMP很容易被误认为是纯粹有害的。然而，健康个体中存在基本水平的EMP，具有潜在的细胞保护蛋白和受体[45]。EMP对内皮完整性也具有潜在有益作用，如刺激血管修复，控制细胞死亡机制或抗原呈递细胞支持的细胞保护活性以及诱导适应性免疫。在脓毒症中，EMP最初被认为是传递对内皮功能有害的生物信息，进而引发凝血和死亡。事实上，EMP通过携带功能性内皮蛋白C受体和抗原呈递细胞在脓毒症中具有有益的作用。此外抗原呈递细胞阳性的EMP能抑制促凝微粒的释放，并通过减少细胞凋亡对内皮细胞具有保护作用[46]。EMP还可通过Akt/eNOS信号和减少氧化应激预防脂质诱导的内皮损伤[47]。还有研究表明，EMP可利用血液代谢物合成还原型辅酶Ⅱ，为其抗氧化机制提供燃料。并且衰老EMP比年轻EMP具有更强的活性氧清除能力[48]。

EMP在促进血管生成方面也可能有双面作用。EMP可能是缺血组织血管修复的内源性生存信号，但促进血管生成也可能对癌症扩散、增殖性糖尿病视网膜病变或动脉粥样硬化斑块失稳产生影响[49]。以上研究表明，EMP在各种生理过程中具有复杂而矛盾的作用，可促进或抑制凝血、炎症或血管生成。EMP具有有益作用的关键是其血浆水平保持适当平衡，过量或不足都会产生不利影响[45]。

4 EMP的检测方法及在临床研究中存在的问题

尽管显微镜、酶联免疫吸附试验及功能测定等方法均可用于微粒检测，但流式细胞术是目前微粒分析的金标准，能分析大量微粒和提供有关微粒特性的信息，并可进行多重标记[50]。其具体方法为：首先用已知直径的标准微球进行尺寸校准，圈定0.1～1 μm范围的门；其次对EMP进行标记，同时定量。标记EMP常用的方法有两种，一是当血管内皮细胞被不同病理因素刺激时，会产生不同表型的EMP，常被作为检测EMP的标志物。用EMP自身带有的特异性抗原标记抗体、结合及测定。常用的标志物有CD144+、CD106+、CD62E+和CD31+/CD42b-。二是用Annexin-V测定PS+EMP，Annexin-V是Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有超强的亲和力。定量EMP也有两种方法：一是在分析前的样品中加入已知浓度和体积的微球，间接计算样品微粒浓度；二是预先确定流式细胞仪的流速，则可计算每个分析体积的样品微粒数[51]。

然而，目前EMP在临床研究中存在一定的局限性。各种分析前变量，如样本采集、离心转速、缓冲液、试剂和冻融等因素均可能对分析结果产生影响[52]。此外，用Annexin-V分析EMP时只能检测到表面带有PS的EMP亚群，可能导致测量的不全面性。内皮细胞上Anexin-V结合位点的显著增加只发生在凋亡中，并且优先富集在由凋亡内皮细胞衍生的EMP上，这可能导致因内皮细胞活化而释放的EMP无法被检测到[51]。EMP的异质性以及用单一标志物标记总EMP的效率低下，导致了当前临床研究中EMP水平差异较大。因此，检测方法的优化和标准化对于正确定量EMP具有重要意义。目前，对EMP体内释放时间窗的研究还不多见，对循环中微粒清除机制的研究也很有限。

5 小结和展望

越来越多的证据表明，EMP是新的生物信息传递者并且与多种疾病病理过程密切相关。进一步研究EMP释放和清除的具体触发因素，探索EMP在何时以及如何发挥不同的作用，有助于将其生物学意义延伸至疾病风险分层和预测分析，从而全面地监测血管健康，在临床症状明显之前即可预知疾病。总的来说，目前对微粒的组成、产生和靶向性的理解非常有益。随着研究的深入，EMP的作用将一步步被揭示，这可为日后评价疾病提供新的信息，为从新的角度看待疾病提供支点，也会为转化医学领域如诊断和治疗开创新的契机。EMP成为药物靶点或药物载体的潜力令人期待，它开启了许多研究领域，最终将使患者受益。