葛建丽 刘敏洁 徐更田 赵 晓 何好超

甲状腺癌为临床常见恶性肿瘤，发生率约占全身恶性肿瘤的1%。超声为筛查最常见方式，常规二维超声检查能够有效检出甲状腺结节，但对结节性质的评估价值有限[1-2]。超声造影作为新兴定量超声检查技术，可实施评估目标组织器官血流情况，并判断其功能状态及性质，明显提高超声诊断的分辨力、敏感性和特异性[3]。相关研究指出，近年来超声造影发展迅速，可评价肿瘤内微血管灌注情况，超声造影定量参数可用于肿块良恶性鉴别，在甲状腺良恶性结节鉴别方面的应用逐渐增加[4]。此外，有研究指出，明确恶性肿瘤恶性生物学行为有助于开展针对性干预措施，从而改善患者预后[5]。基于此，本研究在探究超声造影参数对甲状腺癌的诊断价值基础上，进一步研究其与病灶组织恶性生物学行为的内在联系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年8月至2019年7月我院117例接受超声造影检查的甲状腺结节患者，根据细针穿刺活检结果判断结节良恶性，其中良性76例作为对照组，恶性41例作为研究组。对比2组一般资料，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料对比

1.2 选例标准

纳入标准：①均行超声造影检查；②无超声造影检查禁忌；③均经细针穿刺活检确诊；④无甲状腺手术史；⑤既往未接受相关治疗；⑥患者及家属知晓本研究，已签署同意书。

排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②精神疾病患者；③伴有全身感染性疾病者；④严重心脑血管疾病患者；⑤肺结核、乙肝等传染性疾病患者；⑥血液系统疾病患者；⑦肝肾功能严重障碍者；⑧妊娠或哺乳期女性；⑨不能配合完成研究者。

1.3 方法

超声造影检查：采用美国GE公司生产的Voluson E8超声仪，探头频率5.0～12.0 MHz。患者平躺，首先对颈部、甲状腺及其周围行二维超声检查，从纵横斜多切面扫查，观察并记录结节位置、大小、边界等基本情况，作出超声造影检查前初步诊断，切换至超声造影模式。采用注射器抽取2 ml超声造影剂，经肘部浅静脉快速推注，随后采用5 ml生理盐水冲管。检查时探头及患者应保持不动，持续观察3 min以上。选取感兴趣区域并采用软件获取时间-强度曲线，定量分析并获取超声造影参数，包括曲线下面积(area under the curve，AUC)、达峰时间(time to peak，TTP)、平均通过时间(mean transit time，MTT)、峰值强度(Peak)。

癌细胞恶性生物学特征检查：经细针穿刺采集所有患者治疗组织标本，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测目标基因表达量，首先采用磷酸缓冲盐溶液清洗标本组织，然后行组织碾磨、细胞裂解、总RNA沉淀、清洗干燥、RNA纯度测定、样品cDNA合成、目标基因合成。目标基因包括血管新生基因表达量[血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、中枢性黏液表皮样瘤(central mucoepidermoid tumor，c-met)、缺氧诱导因子α(hypoxia inducible factorα，HIF-α)]，侵袭基因表达量[趋化因子受体4(chemokine receptor 4，CXCR4)、特异结合蛋白1(special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)、金属蛋白酶解离素9(A disintegrin and metalloproteinase 9，ADAM9)]，增殖基因表达量[蛋白磷酸酶4调节亚基1(protein phosphatase 4 regulates subunit 1，PP4R1)、靶向Xklp2靶蛋白(Targeting protein for Xklp2，TPX2)、线粒体促凋亡蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)]及自噬基因表达量[Beclin1蛋白(Beclin1)、磷酸酶张力蛋白样同源物(tension protein analogue，PTEN)、小ras同源蛋白Ⅰ(A ras homologue member Ⅰ，ARHⅠ)]，应用公式2-ΔΔct进行定量分析。

1.4 观察指标

(1)2组超声造影参数(AUC、TTP、Peak、MTT)。(2)探究AUC、TTP、Peak、MTT对甲状腺癌的诊断价值。(3)2组病灶组织中血管新生基因表达量(VEGF、c-met、HIF-α)。(4)2组病灶组织中增殖基因表达量(PP4R1、TPX2、Smac)。(5)2组病灶组织中侵袭基因表达量(CXCR4、SATB1、ADAM9)。(6)2组病灶组织中自噬基因表达量(Beclin1、PTEN、ARHI)。(7)探究超声造影参数与病灶组织中血管新生、增殖、侵袭及自噬基因表达的相关性。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 2组超声造影参数

研究组AUC、TTP、Peak、MTT均较对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组超声造影参数对比

2.2 ROC分析超声造影参数对甲状腺癌的诊断价值

分别绘制AUC、TTP、Peak、MTT单一、联合诊断甲状腺癌的ROC曲线，显示各指标联合诊断甲状腺癌的AUC为0.894(95%CI为0.823～0.943)，高于AUC、TTP、Peak、MTT单一预测的AUC 0.792(95%CI为0.707～0.862)、0.814(95%CI为0.732～0.880)、0.803(95%CI为0.720～0.871)、0.788(95%CI为0.702～0.858)，联合诊断甲状腺癌的最佳敏感度为80.49%，特异度为85.53%。见图1。

图1 ROC分析单一及联合超声造影参数对甲状腺癌的诊断价值

2.3 2组病灶组织中血管新生基因表达量

研究组VEGF、c-met、HIF-α基因表达量均较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)；研究组PP4R1、Smac基因表达量较对照组低，TPX2基因表达量较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)；研究组CXCR4、SATB1、ADAM9基因表达量较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)；研究组Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表达量较对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组病灶组织中血管新生基因表达量对比

2.4 超声造影参数与病灶组织中血管新生、增殖、侵袭及自噬基因表达的相关性分析

超声造影参数AUC、TTP、Peak、MTT与病灶组织中癌细胞恶性生物学特征标志物VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表达量呈负相关关系，与PP4R1、Smac、Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表达量呈正相关关系(P<0.05)。见表4。

表4 超声造影参数与病灶组织中血管新生、增殖、侵袭及自噬基因表达的相关性分析

3 讨论

3.1 研究背景

目前，细针穿刺活检为临床鉴别甲状腺结节良恶性的“金标准”，但属于有创检查，临床应用具有一定局限性[6]。二维超声是筛查甲状腺结节的首选影像学方法，可清晰反映甲状腺结节数量、位置、与周边组织的关系等，但部分恶性结节超声表现复杂，存在一定的交叉、重叠，致使二维超声在具体结节良恶性鉴别中存在一定局限性，因此漏诊、误诊率较高[7]。近年来，超声造影技术得到长足进步，在甲状腺结节良恶性鉴别中的作用越来越受临床重视。

3.2 超声造影鉴别甲状腺结节良恶性的价值

超声造影是利用造影剂反映、观察组织的血流灌注情况的技术方法，通过导管将造影剂注入浅静脉，根据恶性肿瘤内部血供丰富的特征，造影剂流经病灶血管可发生参数水平异常，不同性质的肿瘤时间-强度曲线存在显著差异，这是超声造影技术鉴别肿块良恶性的主要机制[8]。汪彩英等[9]研究选取178例甲状腺结节患者作为研究对象，经超声造影检查发现甲状腺癌组患者的超声造影参数AUC、Peak水平低于甲状腺良性结节组。蒙秋凤[10]通过对218例接受甲状腺结节切除术的患者的研究，也发现超声造影在甲状腺良恶性鉴别方面具有良好效果，甲状腺癌组患者TTP、MTT水平低于甲状腺腺瘤组患者。本研究结果中，恶性甲状腺结节患者的超声造影参数AUC、TTP、Peak、MTT均显著低于良性甲状腺结节患者，与上述研究结果一致，分析其原因在于：恶性甲状腺结节内新血管多，且通透性高、排列杂乱，造影剂流过时阻力较大，直接导致超声造影参数降低[11]。且本研究进一步通过ROC曲线分析发现，AUC、TTP、Peak、MTT在甲状腺癌诊断方面均具有较高应用价值，尤其是各参数联合诊断，AUC高达0.894，大于超声造影各参数单一诊断，联合诊断的最佳敏感度为80.49%，特异度为85.53%，诊断效能得到良好改善，有助于甲状腺癌患者的早期诊断及治疗，应用价值非常高。

3.3 超声造影参数与恶性结节恶性生物学特征的关系

近年来大量研究指出，病灶内新血管生成是恶性肿瘤增殖的基础[12-13]。VEGF作为促进血管新生的主要因子，参与肿瘤血管生成的特异性非常高，且作用强，被认为是恶性肿瘤“血管生成开关”[14]。c-met是一种膜受体，能识别肝细胞生长因子并与之结合，发挥促进血管新生的作用[15]。HIF-α是乏氧相关转录因子，在调节肿瘤细胞对缺氧环境适应性方面具有重要作用，其表达增加可促进肿瘤增殖，也可反映肿瘤内部微血管密度[16]。SATB1是调节众多肿瘤细胞侵袭转移的基因，具有上调金属蛋白酶表达、促进炎性因子表达的作用，同时能刺激PI3K/Akt信号通路激活，增强肿瘤细胞的迁移侵袭能力[17]。CXCR4由骨髓基质细胞及相关间皮细胞分泌，与特异性配体结合后可直接参与肿瘤细胞的增殖、浸润、转移，李鲁申[18]、李剑[19]研究均证实其在恶性肿瘤中呈异常高表达状态。ADAM9是一种金属蛋白酶解离素，可降解细胞基质，促进细胞接触，具有促进肿瘤细胞侵袭转移的作用[20]。PP4R1参与DNA修复、细胞应激等多种重要的细胞进程，其表达降低可激活IκB激酶，并促进肿瘤细胞增殖[21]。Smac为促凋亡因子，可解除凋亡抑制蛋白对caspase-3、7、9等的抑制作用，从而抑制肿瘤细胞增殖[22]。杨忠信等[23]报道指出，TPX2在纺锤体组装及形成过程中发挥重要作用，TPX2异常高表达可促进肿瘤细胞染色体基因异常、扩增等。本次研究发现，恶性甲状腺结节患者VEGF、c-met、HIF-α、CXCR4、SATB1、ADAM9及TPX2基因表达量均高于良性结节患者，PP4R1、Smac基因表达量低于良性结节患者，提示恶性甲状腺结节内存在血管新生旺盛，肿瘤细胞的侵袭、增殖能力高。进一步经相关性分析发现，恶性甲状腺结节患者超声造影参数与病灶组织中VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表达量呈负相关，与PP4R1、Smac基因表达量呈正相关，提示超声造影参数不仅能鉴别甲状腺肿瘤良恶性，同时有助于评估肿瘤内血管新生、侵袭和增殖能力。有报道指出，肿瘤细胞的自噬作用是其能动过程，是通过自噬泡内溶酶体溶解变性、坏死细胞器的过程，自噬过程发生异常是导致肿瘤发生的主要因素之一[24]。Beclin1是近年来新发现的抑癌基因，其表达增加可发挥促进癌细胞凋亡及去分化作用，且能加速肿瘤细胞自噬，调节其他蛋白定位至自噬前体，促进自噬体的形成[25]。PTEN、ARHⅠ均为临床常见抑癌基因，PTEN具有双特异磷酸酶活性，主要通过促进自噬体形成发挥抑制肿瘤发生发展的作用，ARHⅠ在恶性肿瘤细胞内的表达较低或缺失能导致自噬过程受阻[26]。本研究发现，恶性甲状腺结节患者的Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表达量显著降低，且与甲状腺癌患者超声造影参数呈正相关关系，充分表明恶性甲状腺结节内存在自噬障碍，通过超声造影检查可在一定程度上反映出自噬障碍程度。

综上可知，超声造影参数在甲状腺癌诊断中具有较高应用价值，且能指导临床评估癌细胞恶性生物学特征，具有较高临床应用价值。