王艳云 高明敏 姚 丽 张永红

恶性黑色素瘤是黑色素细胞发生的恶性肿瘤，以中老年人为主要发病对象，随着年龄增加发生率有升高趋势[1-3]，目前恶性黑色素瘤的治疗仍然以外科手术为主，但是术后多需要进行配合化疗以延长患者生存率。Nodal是1种胚胎成形素，是转化因子β超家族成员之一，其与细胞的分化、增殖等有关，而且也与肿瘤发生、血管形成、损伤修复等有关[4-6]。恶性黑色素瘤的生长环境具有低氧的特点，因此，本研究对低氧对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的影响进行了研究，以尝试分析恶性黑素瘤A375细胞内低氧的环境中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达情况，现将相关研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞来源于北京中科院科研中心，SB-431542及氯化钴(CoCl2)均来源与美国 Sigma公司，人抗鼠 Vimentin抗体、人抗鼠Nodal抗体、人抗鼠 ALK7抗体均来源于美国 Santa Cruz公司，人抗鼠 MMP2抗体来源于英国 Abcam公司。HRP标记羊抗兔 IgG来源于美国 Bioworld公司，HRP标记羊抗小鼠IgG来源于美国 Bio-world公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法及低氧环境的设置 将冷冻储存的A375细胞复苏后置于含有10%FBS的完全培养基中进行培养，培养条件：温度37 ℃，5%CO2，恒温细胞孵育箱内孵育培养。每间隔24 h换培养液1次，在显微镜下观察到培养的细胞已在培养基内布满80%面积后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在离心机内以3 000 r/min转速、4 ℃温度条件下离心，然后按照1∶2进行传代培养。参考相关文献的方法[7]，以CoCl2诱导构建A375细胞内的低氧环境。

1.2.2 SB-431542阻断Nodal信号通路的方法 在A375细胞培养到3～8代对数生长期后对细胞进行SB-431542阻断，取5 μmol/l、10 μmol/l、20 μmol/l、30 μmol/l、40 μmol/l浓度的SB-431542母液，后在96孔板内每孔接种5×103个细胞后进一步培养12 h，在细胞贴壁后将不同浓度的SB-431542母液分组加入，每组为5个复孔，加入SB-431542母液后温度37 ℃、5%CO2的条件下进一步孵育培养直至72 h，分别观察24 h、48 h、72 h时的阻断结果。

1.2.3 A375细胞增殖的影响检测方法 以MTT法继续检测SB-431542对A375细胞增殖活力的影响，在 SB-431542阻断A375细胞增殖后，在每孔加入MTT溶液20 μl，加入时避光，然后继续培养4 h，将培养液吸除后加入150 μl的DMSO，震荡10 min，将晶体充分溶解，然后用波长为490的酶联仪对每孔的吸光度值(OD)进行测定。

1.2.4 迁移相关蛋白表达的检测方法 以Western Blot方法检测相关蛋白水平。A375细胞放置于6孔板内，每孔A375细胞个数为5×105个，培养之贴壁，吸除培养液，设置空白对照组、CoCl2组、SB-431542阻断组和CoCl2+SB-431542组，每组为6孔，根据设置条件分别进行相应的干预，以BCA法计算蛋白浓度，然后加入SDS-PAGE电泳及目标蛋白，通过转 PVDF膜及5%的脱脂牛奶温室封闭等处理，最后加入目标一抗蛋白，在4 ℃下孵育过夜，隔日进行洗膜后加入目标蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h 30 min，最后采取ECL法显影后对目标蛋白表达水平采用Image Lab软件测定分析表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度SB-431542在不同时点对A375细胞增殖的阻断结果

不同浓度的SB-431542阻断A375细胞Nodal信号通路后细胞形态无明显改变，以上不同浓度阻断24 h、48 h、72 h时A375细胞增殖活力比较差异有统计学意义(F=152.39，P<0.05)，随着时间增加细胞活力明显增强，但是随着浓度增加，细胞活力随之下降，SB-431542对A375细胞增殖的阻断具有剂量和时间依赖性，见表1。SB-431542浓度为 10 μmol/l阻断A375细胞后继续培养48 h时细胞增殖活力低的同时毒性也降低，因此本研究后续相关研究中SB-431542阻断A375细胞的浓度和时间均选择此条件下进行相关研究。

表1 不同浓度SB-431542在不同时点对A375细胞Nodal信号通路阻断结果

2.2 各组不同条件下Nodal及细胞迁移相关蛋白表达

各组Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表达比较差异有统计学意义(F=44.283、111.481、104.34、92.647，P<0.05)，CoCl2组A375细胞内 Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表达均较空白对照组上调(t=10.410、21.127、43.274、/10.125，P<0.05)，与CoCl2组比较SB-431542阻断组、CoCl2+SB-431542组表现为以上蛋白表达下调(SB-431542阻断组:t=24.374、20.928、40.291、10.765，CoCl2+SB-431542组:t=15.319、7.259、6.306、4.718，P<0.05)，见表2。

表2 各组不同条件下Nodal及细胞迁移相关蛋白相对表达量

3 讨论

恶性黑色素瘤的发生发展是1个多因素参与的复杂过程，其机制仍然不是很清楚[8-10]，但是研究显示，恶性肿瘤的发生及发展与胚胎发育过程有一定的相关性。Nodal作为转化因子β超家族成员之一，研究显示Nodal可诱导干细胞的分化及参与到原始胚层的形成等途径[6]，在胚胎的不同发育时期Nodal信号均对其进行调控，随着胚胎的发育，除了在胎盘、卵巢上皮、子宫内膜等生殖系统，Nodal作为“胚胎信号”会逐渐关闭，但是有研究发现在子宫内膜癌、胆囊癌、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤中也能检测到Nodal表达通道被再次重启[11-13]，研究证实在以上恶性肿瘤组织中可检测到Nodal的表达上调，同时还与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关。

肿瘤组织内除了肿瘤组织外还有成纤维细胞、免疫细胞及内皮细胞等，共同构成了恶性肿瘤的微环境，但是这种微环境并不是固定不变化的，低氧环境是大多数实体瘤生存不可缺少的条件，大多数的恶性肿瘤在低氧环境中可以生存。MMP2是基质金属蛋白基因家族成员之一，研究发现与抑制细胞迁移密切相关[14-15]，对肿瘤血管有促进新生血管生成作用。Nodal的信号转导由位于细胞膜上的Ⅰ型受体(ALKs)和Ⅱ型受体(ActRII)介导，因此ALK7是Nodal信号通路中主要的受体靶点，研究显示，ALK7的阻断可阻断Nodal信号通路[16]。Vimentin属于Ⅲ型中间丝，中间丝又是细胞结构的主要组成部分，研究显示[17-18]Vimentin在侵袭性的恶性肿瘤中表达会明显升高，而且与肿瘤的转移和预后密切相关，对细胞的凋亡过程也有影响。在恶性黑色素瘤患者的肿瘤组织中，Nodal及其相关蛋白的表达是升高的[19]，以上相关蛋白也与恶性黑色素瘤的转移及预后密切相关[20-23]。

恶性黑色素瘤普遍分化程度较低，相对于高分化恶性肿瘤，恶性黑色素瘤更容易处于低氧的微环境状态，因此，本研究对低氧状态下对恶性黑素瘤A375细胞中Nodal及细胞迁移相关蛋白表达进行了研究，采取CoCl2构建低氧环境模型，以SB-431542作为阻断Nodal信号通路的阻断剂，观察了最终Nodal及细胞迁移相关蛋白表达的变化，结果显示低氧环境下Nodal及MMP2、ALK7、Vimentin表达均出现上调现象，表明低氧环境可促使恶性黑色素瘤A375细胞中Nodal的诱导进一步表达，而且迁移相关蛋白MMP2、ALK7、Vimentin也可能参与了肿瘤的转移和扩散。同时，以SB-431542作为阻断Nodal信号通路的阻断剂，Nodal信号通路被不同程度阻断，A375细胞增殖出现不同程度抑制，研究表明，SB-431542可抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移。分析A375细胞在低氧环境下加入SB-431542，虽然将单纯低氧环境时以上蛋白水平表达有所下调，但是相对于未经处理的空白对照组细胞，MMP2、ALK7、Vimentin的表达仍然高于空白对照组细胞，表明低氧环境下的A375细胞即使采取SB-431542阻断，仍然存在一定程度的增殖、侵袭和迁移能力，低氧是A375细胞增殖、侵袭和迁移的主要条件。

综上所述，低氧环境可诱导恶性黑色素瘤A375细胞中Nodal及MMP2和Vimentin的表达上调，这可能与A375细胞的迁移和侵袭恶化有关，同时通过SB-431542可阻断细胞增殖的Nodal信号通路。