林 萍 庄娇容 林茂增 许淑娟 卢蔚薇 滕 飞 蔡少华

急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)是1种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞的恶性肿瘤性疾病[1]。ALL是儿童常见的恶性肿瘤之一，发病率与病死率在儿童疾病中均排名首位，儿童期(0～9岁)为ALL的发病高峰，可占儿童白血病的70%以上[2-3]。目前，已有大量研究提示，Neuropilin-1(NRP-1)在多种癌症包括急性淋巴细胞中表达，是ALL治疗潜在的靶点[4-8]。

本研究的目的是通过构建具有NRP-1靶向性自组装多肽(P16)作为递送系统，与化疗药柔红霉素(daunorubicin，DRN)自组装成纳米颗粒(P16/DRN复合物)。NRP-1靶向性自组装多肽的结构及其与柔红霉素的自组装过程如图1所示，N端带负电荷的序列(EEDEEDEED)，在生理pH=7.4条件下呈负电，可以与带正电的柔红霉素通过静电力结合。C端(RPAKPAR)为Teesalu等[9]筛选出可与NRP-1特异性结合的NRP-1靶向肽。C段与NRP-1结合后，可通过NRP-1受体介导药物进入肿瘤细胞。故利用该NRP-1靶向性自组装多肽作为递送系统，与柔红霉素自组装成纳米粒后，可以增加柔红霉素的水溶性和稳定性，C端序列使柔红霉素具有白血病细胞的靶向性和提高柔红霉素进入白血病细胞，从而增加化疗效果。

图1 NRP-1靶向性自组装多肽与柔红霉素自主装示意图

1 材料与方法

1.1 细胞与细胞培养

人急性淋巴细胞性白血病CCRF-CEM细胞购买于上海研生实业有限公司，并由上海科维创生物科技有限公司使用慢病毒介导的shRNA基因沉默技术构建NRP-1敲低型CCRF-CEM细胞。上述细胞分别记为野生型CCRF-CEM(WT-CCRF-CEM)和NRP-1敲低型CCRF-CEM细胞(KD-CCRF-CEM)。细胞均使用CCRF-CEM细胞专用培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 试剂

NRP-1靶向性自主装多肽P16(EEDEEDEEDRPAKPAR)由上海强耀生物科技有限公司合成；柔红霉素购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；细胞周期荧光法检测试剂盒与多肽含量定量检测试剂盒购买于上海生物工程股份有限公司。

1.3 P16/DRN纳米复合物的制备、纯化与表征

将P16多肽冻干粉溶解于PBS缓冲液中，配制成0.2 mmol/ml的P16溶液。同时，取柔红霉素粉末用PBS缓冲液配制成0.2 mmol/ml的DRN溶液。分别取1 ml的上述两种溶液混合，避光搅拌10 min后，冰浴条件下超声分散5 min。超声后，12 000 g离心30 min，取上清液，经30 nm滤孔的超滤离心管纯化后，送于上海鑫潼生物科技有限公司进行透射电镜、粒径表征。参考文献报道的方法[10-12]，高效液相色谱绘制DRN和P16蛋白质的标准曲线，并计算纯化后的上清液DRN与P16多肽的浓度，计算载药量和包封率。

1.4 P16/DRN纳米复合物NRP-1靶向性检测

取对数生长期的野生型CCRF-CEM(WT-CCRF-CEM)和NRP-1敲低型CCRF-CEM细胞(KD-CCRF-CEM)细胞，细胞全蛋白提取试剂盒提取总蛋白后，Western Blot检测WT-CCRF-CEM和KD-CCRF-CEM细胞的NRP-1蛋白表达含量。另外取对数生长期WT-CCRF-CEM和KD-CCRF-CEM细胞按1×105/孔接种于6孔板中，培养6 h后，加入P16/DRN纳米复合物(100 μl/孔)继续培养6 h。收集细胞，PBS轻轻洗涤3次以除去非特异性结合的纳米复合物。滴片固定后，Hoechst核染后共聚焦显微镜检测两种细胞的DRN自带荧光强度。

1.5 P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞增殖的影响

分别取对数生长期的野生型CCRF-CEM 按1×105/孔的浓度接种于24孔板中。培养6 h后，分别按下列分组并做相应处理：①PBS组：每孔加入100 μl PBS；②DRN组：每孔加入DRN溶液100 μl；③P16/DRN纳米复合物组：每孔加入P16/DRN纳米复合物溶液100 μl。其中，根据测得的P16/DRN纳米复合物中的浓度，调节DRN溶液的浓度，使两者DRN浓度相同。每组设置4个时间点，每个时间点设置6个复孔。分别在6 h，12 h，24 h和48 h使用全自动细胞计数仪计算处理组细胞数，根据公式细胞增殖率=各时间点细胞数/处理前(0 h)细胞数，比较不同分组间的细胞增殖率。

1.6 P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞凋亡的影响

分别取对数生长期的野生型CCRF-CEM按1.5中的分组方法并做相应处理，分别在24 h和48 h收集细胞并用 500 μl Binding buffer重悬细胞，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI 染色液，混匀后室温孵育15 min。孵育完毕收集细胞用预冷 500 μl PBS 重悬后流式细胞仪检测，以PBS处理组为阴性对照，计算各时间点与不同处理组间细胞凋亡率。

1.7 统计学方法

本研究统计均应用SPSS 22.0统计学软件处理，定量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，检验水准为P<0.05。

2 结果

2.1 P16/DRN纳米复合物的表征

将P16多肽溶液与柔红霉素溶液按1∶1比例混合后，经搅拌、超声分散、离心后，上清液为P16/DRN纳米复合物。透射电镜下(图2A)，可见该纳米复合物粒径约为100 nm的球形颗粒，粒径分布均匀。该结果与马尔文粒径分析仪检测结果相符，马尔文粒径分析仪提示，形成的纳米复合物平均粒径呈现正态分布，平均粒径为(114.92±17.33)nm(图2B)。

图2 P16/DRN纳米复合物的表征结果

通过梯度浓度柔红霉素溶液绘制标准曲线，高效液相色谱仪测得P16/DRN纳米复合物溶液中，DRN浓度为0.83 mmol/ml，P16浓度为1.0 mmol/ml。可知在上述反应体系中，DRN为过量的反应底物。每1 mmol的P16多肽可与0.83 mmol/ml的柔红霉素结合，形成稳定的纳米复合物，即DRN的载药量和包封率分别为0.83 mmol/ml和83%。

2.2 P16/DRN纳米复合物NRP-1靶向性检测

Western Blot检测WT-CCRF-CEM和KD-CCRF-CEM细胞的NRP-1蛋白表达含量，结果如图3A所示，NRP-1蛋白在野生型CCRF-CEM(WT-CCRF-CEM)细胞呈高表达，而NRP-1敲低型CCRF-CEM(KD-CCRF-CEM)表达量明显较WT-CCRF-CEM低。三次独立Western Blot结果如图3B所示，KD-CCRF-CEM细胞组的NRP-1蛋白表达量明显较WT-CCRF-CEM细胞组低，差异有统计学意义。

图3 P16/DRN纳米复合物NRP-1靶向性检测

P16/DRN纳米与WT-CCRF-CEM和KD-CCRF-CEM细胞共孵育6h后，可在WT-CCRF-CEM细胞组检测到明显的红色荧光，为柔红霉素的自带荧光。而KD-CCRF-CEM组的细胞红色荧光量明显较WT-CCRF-CEM组低。结果提示，由于野生型细胞高表达NRP-1，可在P16的作用下，促进P16/DRN纳米复合物与细胞结合并诱导复合物进入细胞。即P16/DRN纳米复合物仍保留NRP-1的靶向性和介导入胞的能力。

2.3 P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞增殖的影响

根据上述结果，可知所制备的P16/DRN纳米复合物溶液中，DRN浓度为0.83 mmol/ml。故DRN组使用的DRN溶液也调节浓度为0.83 mmol/ml。各分组在四个时间点的细胞增殖率如图4所示。在24 h和48 h时间点，DRN组与P16/DRN组细胞增殖率较PBS组低，P<0.05，结果提示，单纯的DRN和P16/DRN纳米复合物均能明显抑制CCRF-CEM细胞的增殖。此外，在24 h和48 h两个时间点，P16/DRN组的细胞增殖率也较DRN组低，P<0.05，结果提示，DRN与P16形成P16/DRN纳米复合物后，具有更高的细胞增殖抑制率。

图4 DRN与P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞增殖的影响

2.4 P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞凋亡的影响

分别取对数生长期的野生型CCRF-CEM按1.5中的分组方法并做相应处理，分别在24 h和48 h后，以PBS组为阴性对照，流式细胞仪检测各组的细胞凋亡率。三次独立实验的流式细胞术结果如图5所示，在24 h，DRN处理组细胞凋亡率为(31.11±6.51)%，而P16/DRN纳米复合物处理组的细胞凋亡率为(46.64±7.88)，P<0.05；在48 h，DRN处理组和P16/DRN纳米复合物处理组的细胞凋亡率分别为(44.72±9.13)%，( 64.72±12.76)%，P<0.05。上述结果提示，P16/DRN纳米复合物较同浓度的单独DRN处理组具有更高的细胞凋亡率，即P16/DRN纳米复合物具有更高的细胞毒性。

图5 DRN与P16/DRN纳米复合物对CCRF-CEM细胞凋亡的影响

3 讨论

目前，急性淋巴性白血病的治疗主要依靠化疗，如何提高化疗效果是治愈该病的关键。NRP-1是1995年Satoda等[13]在欧洲爪蟾神经纤维轴突上发现并报道的一种相对分子量为130kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。目前针对NRP-1的研究已经从最早的神经轴突导向逐渐扩展至血管生成、肿瘤增殖与转移、肿瘤免疫等多个方面[14-17]。然而，NRP-1在白血病方面的研究仍不多。刘宇宏等[5]发现，NRP-1在人急性淋巴性白血病CCRF-CEM细胞中高表达。且使用NRP-1单克隆抗体与CCRF-CEM细胞表面的NRP-1结合后，可明显抑制细胞的增殖和迁移，促进肿瘤细胞的凋亡和提高肿瘤细胞的化疗敏感性。结果提示，NRP-1是急性淋巴性白血病治疗的潜在靶点。故本研究也选取NRP-1作为靶点，合成具有NRP-1靶向性自组装多肽，与柔红霉素自组装成稳定的纳米复合物。柔红霉素是急性淋巴细胞常用的化疗。柔红霉素易溶于水，其水溶液相当稳定，在0 ℃或37 ℃能保存3周活力不变。通过与P16结合形成P16/DRN纳米复合物后，可实现柔红霉素的肿瘤细胞靶向投递，并且在P16的介导下，促进纳米复合物入胞，从而增强化疗效果。

扫描电镜结果显示，本研究所制备的P16/DRN纳米复合物为粒径约100 nm的球形结构。共聚焦显微镜观察所制备的P16/DRN纳米复合物，仍保留C端靶向肽的NRP-1靶向能力，可与CCRF-CEM细胞结合并介导P16/DRN入胞。高效液相色谱仪测得P16/DRN纳米复合物溶液中，DRN浓度为0.83 mmol/ml，P16浓度为1.0 mmol/ml。细胞计数仪结果提示，与同浓度的单纯DRN对比，DRN与P16形成P16/DRN纳米复合物后，具有更高的细胞增殖抑制率。同样地，流式细胞术结果也显示，P16/DRN纳米复合物较同浓度的单独DRN处理组具有更高的细胞凋亡率，即P16/DRN纳米复合物具有更高的细胞毒性。

综上所述，本研究制备的P16多肽，可在柔红霉素的促发下，形成粒径约100 nm的P16/DRN纳米复合物。P16/DRN纳米复合物较单纯同浓度的DRN溶液具有更好的化疗效果。后期可进一步研究DRN与P16形成纳米复合物的机制及药物释放机制，为P16多肽的进一步应用提供理论基础。