赵咏梅，张传英，席海林

(四川省遂宁市中心医院 产前诊断实验室，四川 遂宁629000)

数据报道，我国出生缺陷发生率约为4%-6%，是出生缺陷大国[1]。其中染色体异常所造成的出生缺陷是我国常见的严重出生缺陷之一，及时参加产前诊断是阻断出生缺陷发生的关键[2]。无创产前筛查简便、可行、无创，即对发病率高、病情严重的遗传性疾病或先天畸形进行筛查，对检出子代具有出生缺陷的高风险人群再进行进一步确诊是我国目前预防出生缺陷的重要手段[3-4]。早期有研究报道，孕5周后胎儿DNA便能释放至母体内，并在出生后2 h内清除，这也是临床利用胎儿游离DNA(cffDNA)进行产前筛查的基础[5]。如李燕芳等[6]应用cffDNA检测21、18、13三体综合征也取得满意获益。本研究对孕中期高危孕妇进行cffDNA检测，并分析其与高危产前诊断指征相关性，以期为孕中期高危孕妇的产前筛查和诊断提供参考依据，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2018年7月-2019年7月在遂宁市中心医院产前诊断中心接受外周血cffDNA筛查的3176例孕中期高危孕妇，年龄21-45岁；筛查者均符合《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范(2016)》[7]中孕妇外周血cffDNA检测适用范围。包括血清学筛查为临界风险者(筛查风险值在1/1000≤T21风险值<1/270)；高龄(年龄≥35岁)；合并介入性产前诊断禁忌症者；孕20+6周以上错过血清学筛查时间，但要求评估21、18、13三体综合征风险者；夫妇一方有明确染色体异常；胎儿超声检查显示软指标或结构异常者等。具有上述检测指征的孕妇在充分知情同意情况下选择外周血cffDNA产前筛查。

1.2 方法

cffDNA检测：采集孕妇10 ml外周血，置于cell free DNA BCT采血管，颠倒混匀后低温(4℃-8℃)保存待检。将采集管4℃、1 600 g条件下离心10 min，吸取上清液，16 000 g离心10 min，留取上层血浆；应用磁珠法对分离好的血浆样品进行游离DNA提取；Qubit定量分析仪检测血浆cffDNA浓度。应用可逆末端终止测序法构建测序文库，针对cffDNA将下片段DNA末端补平，再与测序通用引物进行接头对接；应用贝瑞和康高通量测序文库构建DNA纯化试剂盒对文库构建产物进行纯化，Stepone QPCR仪对纯化后的DNA文库进行定量检测。NextSeq CN500基因测序仪、参照仪器标准操作规程对构建成功的文库进行检测，将上机测物所得数据上传至贝比安数据分析系统与人类基因组序列进行对比分析，参照Denis Lo计算方法获得Z值。Z值代表计算每条染色体所占比例的评分结果，Z值>3.0样本判定为该染色体三体，<-3.0则提示该染色体单体高危，-3

染色体核型分析：对cffDNA检查高风险的孕妇，经孕妇知情同意后开展超声引导下羊膜腔穿刺，采集20ml羊水常规离心去上清液，保留0.5 ml，与4.5 ml羊水培养基混合后接种于25ml无菌培养管后独立培养箱培养(5%CO2、37℃)，8-10 d后常规制片、烤片、G显带并参照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN，2016)对核型分析结果进行描述。

1.3 统计学分析

SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料用n(%)描述，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕中期高危孕妇产前诊断指征分布3176例孕中期高危孕妇的产前诊断指征分别：高龄(年龄≥35岁)33.63%(1068/3176)、血清学筛查临界风险994/3176(31.30%)、血清学筛查高风险18.29%(581/3176)、不良孕产史2.90%(92/3176)、B超软指标异常2.39%(76/3176)、B超提示胎儿结构异常0.22%(7/3176)、其他11.30%(359/3176)，见图1。

图1 高危产前诊断指征分布

2.2 孕中期高危孕妇的cffDNA检测结果3176例孕中期高危孕妇cffDNA检查结果显示，57(1.79%)例孕妇外周血cffDNA检查结果为高风险，21三体占40.35%，性染色体非整倍体(sex chromosome abnormalities,SCA)其次，见表1。

表1 孕中期高危孕妇的cffDNA检测结果(n，%)

2.3 孕中期高危孕妇外周血中cffDNA与高危产前诊断指征的相关性B超提示胎儿结构异常的孕妇外周血cffDNA检测高风险相对比例最高，为28.57%，其次为血清学筛查高风险(2.75%)、不良孕产史(2.17%)、高龄(1.97%)、 血清学筛查临界风险(1.21%)、其他(1.12%)，见表2。

表2 孕中期高危孕妇外周血中cffDNA与高危产前诊断指征的相关性(n，%)

2.4 cff-DNA产前筛查高风险对胎儿染色体异常的准确性分析57例孕妇外周血cffDNA高风险患者中，染色体核型分析染色体核型异常32例，cffDNA高风险预测21三体的准确率最高，为82.60%，其次为18三体、SCA，见表3。

表3 cff-DNA产前筛查高风险对胎儿染色体异常的准确性分析

3 讨论

据相关资料显示，我国新生儿出生缺陷概率为5.6%，降低出生缺陷倍受社会多方关注。早中期产前筛查和产前诊断更具有临床意义。尤其是孕中期高风险孕妇，要面对创伤性产前诊断的压力，部分孕妇甚至因此拒绝接受产前诊断，这也是羊水穿刺产前诊断接受率低的主要原因之一，从而导致病例漏诊[8-9]。而母体血浆cffDNA无创性产前检查染色体非整倍体作为相对理想、且对胎儿无风险的产前检查途径，无疑为孕中期高危孕妇的产前检查提供了新途径，对降低出生缺陷、提高优生优育率有重要价值[10]。但孕妇外周血cffDNA含量受孕妇体重、孕周等因素影响，存在cffDNA检查误诊或漏诊现象。如张玢等[11]报道孕妇外周血cffDNA无创产前筛查(NIPT)检测失败率为0.088%，这说明cffDNA检查也存在局限性，需与其他相关产前检查手段联合诊断。

当前研究所报道的外周血cffDNA主要侧重于与产前介入诊断结果的比较，而分析孕中期高危孕妇外周血中cffDNA与高危产前诊断指征相关性的报道较少，因此，本研究回顾性分析3176例孕中期高危孕妇的产前筛查资料，着重探究孕中期高危孕妇外周血中cffDNA与高危产前诊断指征相关性。本研究显示，3176例孕中期高危孕妇的产前诊断指征主要为高龄(年龄≥35岁)33.63%、血清学筛查临界风险31.30%、血清学筛查高风险18.29%。其中高龄(年龄≥35岁)比例较高的原因可能与近年国家全面二胎政策的开放有关。血清学筛查人群仅次于高龄，这与国内开展孕妇外周血cffDNA检测的首要指征是血清学筛查临界风险有关[12-13]。cffDNA检查结果显示1.79%的孕妇外周血cffDNA检查结果为高风险，其中以B超提示胎儿结构异常的孕妇外周血cffDNA检测高风险相对比例最高，为28.57%。由此可见，对B超提示胎儿结构异常、外周血cffDNA检测高风险孕妇或应尽可能接受介入性产前诊断，并可依据具体情况考虑是否进一步接受其他相关产前诊断技术检查[14]。B超提示胎儿结构异常的孕中期高危孕妇外周血中cffDNA筛查高风险比例需引起重视。谢佐莲等[15]也报道相似，孕妇外周血cffDNA检测技术可作为产前筛查的有效辅助手段，但基于cffDNA检查技术对性染色体非整倍体异常的阳性预测值较低这一局限性，当cffDNA检测为高风险时，一定要与相关产前诊断技术来验证[16]。本研究进一步与染色体核型分析结果比较，结果显示57例孕妇外周血cffDNA高风险患者中，染色体核型分析染色体核型异常临床为56.14%，cffDNA高风险预测21三体的准确率最高，为82.60%，其次为18三体、SCA。由此也可见，具高危产前诊断指征的孕妇开展cffDNA监测十分必要，对cffDNA高风险群体进一步开展染色体核型分析于优生优育有益。