杨 亚， 闫凤祎， 王 卉， 张克勤

(1. 常熟理工学院 纺织服装与设计学院， 江苏 常熟 215500；2. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215000)

在人体内，骨组织展现出了优异的力学性能，其主要由硬而脆的纳米级钙磷盐和柔软坚韧的有机蛋白质复合而成。从自然界中得到启发，构筑具有不同化学组分的纳微米多级结构是组织工程应用中先进生物材料合成的关键因素。磷酸八钙(OCP)和丝素蛋白(SF)由于各自具有优异的理化性质和生物性能，被认为是合适的骨组织替代材料[1-3]。

近年来，关于材料表面拓扑结构对蛋白质吸附和细胞行为影响的研究吸引了众多关注，相关研究表明，生物材料表面纳米尺度和微米尺度的结构在一定程度上可直接和间接影响细胞的生长行为[4-5]。一般来说，如果植入物被植入活体中，蛋白质包括许多生物活性物质会立即与这些植入物相互作用并吸附在其表面，这种蛋白质吸附过程的研究对于预测生物进程中细胞对基底的响应是至关重要的[6-7]。众多研究者指出，生物材料表面微观结构只有在细胞粘附蛋白存在的前提下才能促进细胞的粘附，表明蛋白质在调控移植生物材料表面一系列细胞行为方面起到了重要的作用[8-9]。相关研究表明，纳米材料的特异性可促进组织替代材料生物性能和力学性能的提高[10-12]。

本文利用电化学沉积技术精确调控纳微米多级结构，探索材料表面理化特征与其力学性能和生物性能的相互关系。在电化学沉积过程中，通过调节SF的质量浓度，精确调控SF/OCP复合涂层的孔隙尺寸和晶带宽度；讨论纳米多级结构表面形貌的变化对牛血清白蛋白(BSA)和纤连蛋白(Fn)吸附以及细胞活力的影响。

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

材料：四水硝酸钙(分析纯)、磷酸二氢铵(分析纯)、二甲基亚砜(DMSO)，国药集团化学试剂有限公司；蚕茧，市售；钛片(Ti)，西格玛奥德里奇贸易有限公司；微量二喹啉甲酸(μBCA)蛋白定量分析试剂盒，安诺伦北京生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，卡迈舒上海生物科技有限公司；纤连蛋白(Fn)， 美国R&D Systems 公司；噻唑蓝(MTT)，西格玛奥德里奇贸易有限公司。

设备：CHI600E型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；S-4800型高分辨场发射扫描电镜(SEM，日本Hitachi公司)；Synergy 4型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；G200型纳米压痕仪(美国KLA公司)。

1.2 试样制备方法

1.2.1 丝素蛋白溶液的制备

将蚕茧剪成合适大小的茧片，称取一定量放入到质量分数为0.5%的Na2CO3溶液中，沸煮45 min后，用去离子水冲洗脱胶丝4～5次，然后自然晾干。将干燥后的丝素撕扯至蓬松状态，放入到浓度为9.3 mol/L 的溴化锂(LiBr)溶液中，在60 ℃下溶解1 h， 用4层纱布过滤溶液中的杂质，用透析袋(截留分子量 6 000～8 000) 对溶液进行透析处理，透析时间为3 d，按常规操作进行换水处理，去除溶液中的溴化锂，最后将透析好的丝素蛋白溶液存放在 4 ℃ 冰箱中备用。

1.2.2 涂层材料制备

采用超纯水配制电解液，配制好的电解液中含0.045 mol/L的四水硝酸钙和0.027 mol/L的磷酸二氢铵，用于制备纯OCP涂层。在上述电解液中缓慢添加一定质量浓度的SF(0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 mg/mL)，并混合均匀，用于制备SF/OCP复合涂层。采用CHI600E电化学工作站，钛片作为工作电极(阴极)，铂电极作为对电极(阳极)，饱和甘汞电极作为参比电极，采用恒电流模式进行电化学沉积。控制电流密度为0.2～1.5 mA/cm2，沉积时间为15 min，沉积温度为75 ℃。在钛基底上沉积纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层。电化学沉积结束后，用超纯水对样品进行冲洗，然后晾干备用。

1.3 测试方法

1.3.1 涂层表面孔洞直径和晶带宽度测试

通过场发射扫描电子显微镜观察涂层表面的形貌特征，打开Image J软件的长度测量工具，测试电镜图像上的孔洞直径和晶带宽度并记录。每种样品分别测试10组，计算其平均值和标准偏差。

1.3.2 涂层的力学性能测试

使用纳米压痕仪对纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL)的力学性能进行测试，分析 2种涂层的弹性模量和硬度差异。每种样品测试 4组， 计算其平均值和标准偏差。

1.3.3 涂层表面蛋白质吸附性能测试

使用微量二喹啉甲酸(μBCA)蛋白质试剂盒检测样品上蛋白质吸附的数量。测试步骤为：将制备好的样品分别放置在24孔培养板中，每孔分别加入配制好的5 mg/mL BSA/PBS(磷酸盐缓冲溶液)蛋白质溶液1 mL。然后将培养板放置在37 ℃孵化箱中孵化4 h，取出样品用PBS清洗3次。将清洗过的样品放置在新的24孔培养板中，每孔加入0.5 mL 体积分数为 5%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，然后将培养板放置在37 ℃恒温振荡器中，振荡20 min 以释放样品表面吸附的BSA蛋白质，最后将溶液收集到新的24孔培养板中，使用μBCA试剂盒测试样品表面BSA蛋白质的吸附量。涂层表面Fn吸附量的测试步骤同上，每孔添加30 μg/mL Fn/PBS蛋白质溶液1 mL进行测试。

1.3.4 涂层表面细胞活力测试

使用人脐血间充质干细胞HUMSCs进行体外细胞培养实验，接种密度为1×105个/cm2，培养时间为1、3和7 d。涂层表面细胞活力测试采用MTT比色实验进行，依检测原理，在一定波长下通过测定其吸光度值可间接反映活细胞数量。MTT溶液配制过程为：称取250 mg MTT粉末放入烧杯中，加入50 mL PBS(0.01 mol/L, pH值为7.4)溶液，在磁力搅拌机上避光搅拌30 min，配制好的溶液用微孔滤膜除菌处理，放置在4 ℃冰箱保存。将待测样品放入到24孔培养板中，每孔加入200 μL MTT溶液，然后放置在培养箱中孵化4 h，将孵化后的样品转移到新的 24孔板中，每个样品中加入400 μL DMSO，摇晃一下放置10 min。最后将每个样品孔的溶液分装到96孔板中，每孔100 μL溶液，每个样品分装3个孔，用酶标仪进行测试。

2 结果与分析

2.1 涂层表面形貌分析

图1为纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层电镜(SEM)照片，图2为其放大的电镜照片。可以看出，在电化学沉积过程中，由于阴极表面氢气泡的产生，在所有制备的涂层表面都形成了均一的三维多孔结构，当一定量的丝素蛋白溶液加入到电解液中时，钛(Ti) 基底表面就会形成具有纳微米多级结构的涂层，随着电解液中丝素蛋白质量浓度的增加，涂层表面孔洞直径和OCP晶体宽度逐渐减小，当丝素蛋白质量浓度高于1.0 mg/mL时趋于稳定。

图1 纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层电镜照片Fig.1 SEM images of pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

图2 放大的纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层电镜照片Fig.2 Enlarged SEM images of pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

图3示出涂层孔洞直径和OCP晶带宽度随丝素蛋白添加量的变化。可以看出：纯OCP涂层的孔洞直径为(19.96±6.96)μm，晶带宽度为(554.33±108.55) nm；随着电解液中丝素蛋白的加入，孔洞直径减小到(1.56±0.22) μm，OCP晶带宽度减小到纳米((26.84 ±8.2) nm)级别。

图3 孔洞直径和OCP晶带宽度随丝素蛋白质量浓度的变化Fig.3 Change of pore size (a) and OCP crystals width (b) in prepared coatings with SF concentration

图4示出SF/OCP复合涂层电化学沉积机制示意图。在电化学沉积过程中，当丝素蛋白加入到电解液中时，在阴极/溶液界面的pH值高于电解液 pH值的情况下，SF和OCP共沉积在阴极表面形成纳微米多级结构。通过调控初始电解液中丝素蛋白溶液的质量浓度，可以非常容易地控制SF/OCP复合涂层的微观形貌。在这个过程中，丝素蛋白不仅在微米级孔状结构的形成方面起到了重要作用，而且在纳米级纤维状OCP微晶的形成上也起到了关键作用。当电流通过电极时，由于水解电化学反应，在阴极表面产生大量动态的氢气泡，如果OCP晶体生长速率与电极表面氢气泡的形成-离开速率相匹配，OCP晶体可围绕氢气泡生长，并沉积在气泡周围。这个过程中，氢气泡扮演着形成孔状结构的软模板。当电解液中加入丝素蛋白后，SF很可能吸附在暴露于溶液中的(100)晶面上，从而抑制OCP晶体的生长。

图4 SF/OCP复合涂层电化学沉积机制Fig.4 Schematic illustration of formation of SF/OCP composite coatings on Ti substrates by ECD technique

2.2 涂层的力学性能分析

表1示出OCP和SF/OCP涂层的弹性模量和硬度。为测量含有丝素蛋白和不含丝素蛋白2种涂层的力学性能差异，选取了丝素蛋白质量浓度为1.0 mg/mL制备得到的SF/OCP复合涂层和纯OCP涂层进行比较。由表1可知，与纯OCP涂层相比，SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL)的弹性模量是其1.5倍，硬度是其4.3倍，表明SF/OCP复合涂层具有更好的力学性能。这可能是由于其结构上的改变，当电解液中添加丝素蛋白时，在涂层表面会形成纳微米二级结构，孔洞直径和OCP晶带宽度的减少能有效地促进SF/OCP复合涂层表面形成更加致密的多孔结构。此外，丝素蛋白和OCP之间的相互交联也有助于复合涂层力学性能的提升。

表1 制备涂层的弹性模量和硬度Tab.1 Elastic modulus and hardness values of prepared coatings GPa

2.3 涂层表面蛋白质吸附性能分析

图5、6示出BSA和Fn在纯Ti基底、纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层上的吸附量。

注：*表示与纯Ti基底相比，p<0.05；#表示与纯OCP涂层相比，p<0.05。图5 BSA在纯Ti基底、纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层上的吸附量Fig.5 BSA adsorption on pure Ti，pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

由图可知，纯OCP涂层上的BSA蛋白吸附量是空白Ti基底上的2倍多，但在SF/OCP复合涂层上的BSA蛋白吸附量保持同一吸附水平，且明显低于纯OCP涂层上 的蛋白质吸附量。Fn蛋白在SF/OCP 复合涂层上的吸附高于纯OCP涂层和空白Ti基底上的吸附，且随着丝素蛋白浓度的增加，复合涂层表面Fn蛋白吸附量增加。

注：*表示与纯Ti基底相比， p<0.05；#表示与纯OCP涂层相比， p<0.05。图6 Fn在纯Ti基底、纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层上的吸附量Fig.6 Fn adsorption on pure Ti，pure OCP coating and SF/OCP composite coatings

众所周知，在体内移植中BSA和Fn是最重要的2种蛋白质，存在于复杂的生物体液和组织中。BSA是一种存在于血浆中的小型球状血清蛋白，有助于调节渗透压和低水溶性营养物质的运输。BSA的分子量较低，为66 kDa，导致其在体液中扩散速度更快。一般来说，在生物学研究中，BSA被用来屏蔽细胞的非特异性粘附位点[6-7,13]。一些研究团队报道了片状HAp粒子因其具有很大部分的b-c晶面而更容易吸附BSA分子[14]。OCP的晶体结构与HAp有着很多相似之处，在OCP磷灰石层中的 4个钙原子和4个磷原子位置与HAp晶体中相应原子几乎完全匹配。BSA蛋白更快的扩散速度和其在优先晶面上更高的吸引力，使其在纯OCP涂层上有更高的吸附量。与纯OCP涂层晶带在(100)晶面上的生长相比，随着丝素蛋白的加入，复合涂层上OCP晶带在这个方向上的生长受到抑制，晶带宽度明显减少。由于BSA分子快速的扩散速度，与SF/OCP复合涂层相比，纯OCP涂层表面具有更大的孔洞尺寸，可以吸附更多的BSA蛋白。

Fn蛋白不仅是最重要的细胞黏附蛋白，可促进生物材料上细胞黏附和迁移，且在早期的成骨分化中也起到了重要的作用。一些研究表明，生物材料表面微观形貌能影响相对大的蛋白质的吸附。Fn蛋白的相对分子质量较高，为250 kDa[15-17]。随着电解液中丝素蛋白质量浓度的增加，SF/OCP复合涂层具有更高的有序结构和更大的表面积。由于表面积的增加，使得其有更多的非特异性Fn蛋白吸附。

2.4 涂层表面细胞活力分析

图7示出HUMSCs细胞在纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层上培养1、3和7 d时的细胞增殖状况。可知，经过1 d的培养后，所有样品之间没有显著性的差异，但经过3、7 d培养后，SF/OCP复合涂层表面的细胞活力明显高于纯OCP涂层，而且具有显著性差异。随着复合涂层中丝素蛋白质量浓度的增加，涂层表面细胞活力明显增加，这种增加趋势随着培养时间的增加越来越明显。尤其在培养第 7 d时，SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL)表面的细胞活力是纯OCP涂层上的1.28倍。经统计分析，在整个细胞培养过程中，SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL) 和SF/OCP复合涂层(1.5 mg/mL)上的细胞活力没有显著性差异，这可能是由于这2种涂层之间具有极其相似的纳微米多级结构。

注：*表示涂层表面细胞活力的显著性差异，p<0.05。图7 HUMSCs在纯OCP涂层和SF/OCP复合涂层上培养1、3和7 d时的细胞活力Fig.7 HUMSCs cell viability on pure OCP coating and SF/OCP composite coatings for 1, 3 and 7 d

在所有复合涂层中，具有更小微米级孔洞尺寸，更细的纳米级晶体纤维和更好的Fn蛋白吸附的SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL)和SF/OCP复合涂层(1.5 mg/mL)显示出更好的细胞活力。细胞实验表明，与具有单一尺度特性的样品相比，纳微米多级尺度的样品能够有效增强细胞活力。

3 结 论

1)本文通过调控电解液中丝素蛋白(SF)质量浓度，采用电化学沉积方法制备出具有有序多孔结构的磷酸八钙(OCP)涂层和具有纳微米多级结构的SF/OCP复合涂层。经研究表明：随SF质量浓度的增加，涂层表面孔洞直径由(19.96 ± 6.96) μm减小到(1.56 ± 0.22) μm， OCP晶体宽度减小到(26.84 ± 8.2) nm；SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL) 的弹性模量和硬度分别比纯OCP涂层增加了大约1.5和4.3倍。

2)SF/OCP复合涂层可选择性地增强Fn的吸附，经7 d细胞培养，SF/OCP复合涂层(1.0 mg/mL) 表面的细胞活力是纯OCP涂层上的1.28倍。