朱 娟，周 英，李颖佳*

(1.中南大学湘雅三医院 检验科，湖南 长沙 410013; 2.长沙市中心医院 检验科，湖南 长沙 410004)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种常见的造血系统恶性肿瘤，约占急性白血病的70%，发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞大量增殖并抑制正常造血，可广泛浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器，表现为贫血、出血、感染和浸润等征象[1]。目前，化疗仍然是治疗急性髓系白血病的主要方式。但是由于化疗药物的骨髓抑制、心脏毒副作用、耐药以及易复发等特点，探索出新的更安全而有效的治疗方式已亟不可待。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)SNHG7是一种典型的发挥原癌基因效应的分子，在多种肿瘤中高表达，可以起到促进肿瘤的恶性表型发展的作用[2-3]。然而，迄今为止，SNHG7与AML及其细胞生物学特征的相关性未见报道。微小RNA-186(micro RNA-186, miR-186)是miRNAs成员之一，其在非小细胞肺癌、宫颈癌等多种实体瘤中表达下调[4]。研究显示，低表达的miR-186与AML患者低生存率有关[5]。相关研究表明，lncRNA可与miRNA相互调控，从而影响肿瘤的发生发展[6]。基于此，本研究对SNHG7通过抑制miR-186对AML细胞耐药性的影响进行了研究，有望为AML的治疗方式提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本：收集中南大学湘雅三医院和长沙市中心医院2018年8月至2019年8月血液科初诊为AML患者(60例)的外周血样本。将60例AML患者标本分为初诊者(26例)和复发/难治者(34例)，另外收集了20例健康志愿者外周血标本作为正常对照。所有标本的使用获得了该院伦理委员会的批准(文号：2019-S000)和患者或家属的知情同意。外周血样本于4 ℃，3 000 r/min离心10 min，用移液枪吸取上层澄黄色血浆至干净的Ep管中，然后吸取0.5 mL血浆样本于另一干净的Ep管中，加入1 mL Trizol充分吹打，最后将处理的血浆存入-80℃冰箱中备用。

1.1.2 细胞系：人AML阿霉素敏感细胞系HL60(ATCC美国菌种保藏中心)，AML阿霉素耐药细胞系HL60/ADM(中国医学科学院天津血液学研究所)。

1.1.3 主要试剂： 阿霉素(adriamycin，ADM)(上海凯方医药科技有限公司)；RPMI-1640培养基(Gibco公司)；Trizol、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(TaKaRa公司)；荧光定量PCR试剂盒(罗氏公司)；CCK8试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；sh-SNHG7及其阴性对照sh-NC、mimic-miR-186和inhibitor-miR-186(上海吉玛基因公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：将HL60及HL60/ADM细胞均置于RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加10% FBS和1%青霉素/链霉素，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。转染使用Lipofectamine 2000试剂，取增殖状态良好的对数期细胞接种至细胞培养板上，过夜孵育后，当细胞汇和度达到70%左右时，按说明书的操作进行转染。继续孵育24 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 荧光定量PCR检测mRNA的水平：使用Trizol提取总RNA。利用反转录试剂盒进行反转录，所有操作按试剂盒的使用说明进行。使用LightCycler 480光定量PCR仪检测基因的表达，反应条件按荧光定量PCR试剂盒的操作说明进行。热循环参数为：95 ℃ 10 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45个循环；最后72 ℃延伸5 min。定量PCR每个反应设置3个平行，实验重复3次。内参用U6或GAPDH。数据分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=实验组(Ct目标基因-Ct内参)-对照组(Ct目标基因-Ct内参)。利用PrimeBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)设计引物序列，各基因及其内参的扩增引物序列详见(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 CCK8法检测细胞增殖：将目的细胞消化后接种到96孔板，每个孔接种约3 000个细胞，每个样品接种3个孔，分别加入不同浓度ADM(0、0.1、1、2、5 和 10 μg/mL)。培养箱中孵育24 h后每个孔内加入10 μL的CCK8试剂。置于培养箱中继续孵育2 h后，450 nm波长处测定吸光度值。计算半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)。

1.2.4 双荧光素酶报告基因实验：通过starBase工具(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测SNHG7与miR-186的结合位点。根据预测结果，分别设计和合成结合位点的野生序列和突变序列(mut-SNHG7和wt-SNHG7)。分别将结合位点的野生序列和突变序列插入荧光素酶报告基因载体(pGL3-Basic)中，再分别与miR-186 mimic(50 nmol/L)或阴性对照共转染HEK239T细胞。 转染后检测各组firefly荧光素酶活性和renilla荧光素酶活性，renilla荧光素酶活性作为内参，firefly荧光素酶与renilla荧光素酶活性的比值为荧光素酶的相对活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SNHG7和miR-186在AML患者中的表达

初诊组和复发/难治组SNHG7的表达显著高于对照组，miR-186的表达显著低于对照组(图1)。表2为临床患者资料。

2.2 SNHG7和miR-186在耐药细胞中的表达

同一浓度ADM处理的HL60/ADM细胞系细胞活力显著大于HL60细胞系(图2A)，同时HL60/ADM细胞系对ADM的IC50值显著高于H60细胞系，为H60细胞系的24.62倍(图2B)。HL60/ADM细胞系中SNHG7的表达比HL60细胞系高1.56倍(图2C)。miR-186在HL60/ADM细胞系中的表达量为HL60细胞系的0.48(图2D)。

2.3 SNHG7对HL60/ADM细胞增殖及耐药的影响

敲低SNHG7后，HL60/ADM细胞中SNHG7的表达显著降低(图3A)。sh-SNHG7组相较sh-NC组，HL60/ADM细胞活力显著下降(图3B)。sh-NC组的IC50值低于sh-SNHG7的IC50值(图 3C)(P<0.05)。

2.4 SNHG7与miR-186靶向结合

插入mut-SNHG7序列后，HEK293细胞共转染miR-186 mimic和mimic NC荧光素酶活性没有差异；而插入wt-SNHG7序列后，HEK293细胞共转染miR-186 mimic荧光素酶活性显著低于共转染mimic NC(图4)。

2.5 miR-186对HL60/ADM细胞增殖及耐药的影响

miR-186 mimic组HL60/ADM细胞中miR-186的表达显著高于mimic NC组，miR-186 inhibitor组HL60/ADM细胞中miR-186的表达显著低于inhibitorNC组(图 5A)。miR-186 mimic组细胞活力及IC50值显著低于mimic NC组，miR-186 inhibitor组细胞活力及IC50值显著高于inhibitor NC组(图 5B,C)。

A.expression of lncRNA SNHG7 in newly diagnosed AML patients, recurrent/refractory AML patients and healthy controls; B.expression of miR-186 in newly diagnosed AML patients, recurrent/refractory AML patients and healthy controls; *P<0.05 **P<0.01 compared with HC group; #P<0.05 compared with ND group (HC.healthy control; ND.un-recurrence patients; RE.patients with reurrence)

表2 临床患者资料Table 2 Basic information of the patients

FAB classification.French-American-British; WBC.white blood cell count; PLT.blood platelet.

3 讨论

目前，AML患者对化学、放射疗法出现耐受现象，导致传统疗法出现治疗瓶颈，成为病死率居高不下的原因之一。因此，寻找AML耐药的分子机制，为疾病诊断、治疗以及克服AML治疗中出现的耐药问题显得尤为重要。

lncRNA在调控癌细胞耐药方面具有重要作用。如，lncRNA OIP5-AS1可以促进骨肉瘤产生顺铂耐药[7]。在AML疾病研究中发现lnc RNA SNHG5、KCNQ1OT1和TUG1等可以增加AML的化疗耐受[8-10]。先前研究报道，lncRNA SNHG7在多种肿瘤中表达上调，在前列腺癌、结直肠癌、胶质瘤中异常表达的SNHG7通过调控肿瘤的增殖侵袭及迁移，促进了肿瘤的发生发展；且SNHG7的高表达与肿瘤的预后负相关，能作为早期诊断的标志物[3]。其作用机制可能是SNHG7在基因转录及翻译等多阶段调控肿瘤的发生发展，进而影响肿瘤细胞的生物学特性。例如，在结直肠癌中，上调的SNHG7能作为内源性竞争RNA结合miR-34a上调GALNT7的表达，促进肿瘤进程[11]。在前列腺癌患者的肿瘤组织中，SNHG7的表达与前列腺癌的预后相关，提示可能成为前列腺癌治疗和预后的靶点[12]。然而，癌分子SNHG7在AML中的调控之前未见有报道。本研究的结果显示，SNHG7在AML患者中高表达，通过促进HL60细胞的增殖及耐药，从而加速AML的进展。

A.HL60 cells and HL60/ADM cells were treated with adriamycin at different concentrations, CCK8 detected cell viability; B.the IC50 value of adriamycin on HL60/ADM; C.expression of lncRNA SNHG7 in HL60 cells and HL60/ADM cells; D.expression of miR-186 in HL60 cells and HL60/ADM cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with HL60 group

A.expression of lncRNA SNHG7 after transfection of sh-SNHG7; B.cell viability after transfection of sh-SNHG7; C.the IC50 value of transfection of sh-SNHG7; *P<0.05, **P<0.01 compared with sh-NC group

A.the binding site of lncRNA SNHG7 and miR-186; B.the luciferase assay was used to detect the binding of lncRNA SNHG7 and miR-186; *P<0.01 compared with mimic NC group

A.expression of miR-186 after transfection of miR-186 mimic and miR-186 inhibitor; B.cell viability after transfection of miR-186 mimic and miR-186 inhibitor; C.the IC50 value of transfection of miR-186 mimic and miR-186 inhibitor; *P<0.05; **P<0.01 compared with NC group

最近的研究结果显示，miRNA在AML的发病及进展中发挥了重要的作用，miR-4792通过靶向 Kindlin-3 促进AML细胞凋亡抑制增殖、迁移和侵袭[13]，miR-582-3p通过影响cyclin B2负调控AML细胞增殖及细胞周期[14]。miR-186在慢性淋巴细胞白血病、自身免疫溶血性贫血、多发性骨髓瘤以及AML患者中同样表达下调，其低表达与患者的不良预后密切相关[7]，但具体机制并未得到深入研究。目前针对miRNA的研究，主要是使用化学合成的miRNA模拟物及miRNA抑制剂，通过细胞转染来增强或抑制内源性miRNA的表达，从而进一步调节靶基因的生物学功能。本研究在耐药细胞HL60/ADR中转染miR-186 mimic以及miR-186 inhibitor使细胞miR-186的水平得到上调或者下调。结果表明，过表达miR-186增加HL60/ADM细胞ADM敏感性，敲低miR-186进一步增加HL60/ADM细胞ADM耐药性。

综上所述，本研究首次在AML中研究SNHG7的表达和功能，SNHG7通过靶向结合miR-186并下调其水平，促进HL60/ADM细胞增殖，起到促癌的作用，为SNHG7有可能成为AML治疗的新思路提供了理论依据。