陈诗恺，陈韭铭，孙顺昌

(上海交通大学医学院附属瑞金医院北院 检验科，上海 201801)

腓骨肌萎缩症是由法国学者及英国学者于1886年同时报道，故称Charcot-Marie-Tooth(CMT)病。CMT是一组临床和遗传均具异质性的遗传性周围神经病，发病率约为1/2 500[1]。目前已发现的CMT依据遗传模式和神经病理特征分为7类40多型[2]。CMT首发临床表现一般为远端肌无力和肌萎缩，进而引起运动障碍。CMT诊断主要依据临床表现、神经电生理检查及家系资料分析等，其分型主要依据遗传模式和神经病理特征。1号染色体开放读码框194(chromosome 1 open reading frame 194, C1orf194)基因编码产物为169个氨基酸的c1orf194蛋白，其分子质量约为19.35 ku。前期研究发现C1orf194基因突变可导致常染色体显性遗传CMT，其发病机制与葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein 75, GRP75)介导的线粒体-内质网间Ca2+流相关，c1orf194蛋白突变体阻断了线粒体-内质网间Ca2+流，导致患者表现为CMT，但具体机制仍不清楚[3]。本研究拟通过蛋白相互作用分析探讨C1orf194基因Ile122Asn突变致CMT机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Hyclone公司)；稳定同位素标记氨基酸(stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC) DMEM(Life Technologies公司)；抗flag M2磁珠、抗flag M2抗体、抗flag tag鼠源单抗及Polybrene试剂(Sigma-Aldrich公司)；pCDNA3.1-myc-C和pCDNA3.1-flag-C质粒(Invitrogen公司)；pLL3.7-CMV-IRES-puro质粒、pMDLg/pRRE质粒、pVSV-G质粒及pRSV-Rev质粒(广州辉骏生物技术公司)；Strep-Tactin琼脂糖珠、抗鼠IgG抗体(美国GE Healthcare公司)；引物、BamHⅠ、XhoⅠ、HindⅢ及ApaⅠ核酸内切酶(生工生物有限公司)；PCR扩增试剂(Promega公司)；PolyFect转染试剂(QIAGEN公司)；人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)细胞和人胚胎肾上皮细胞系HEK-293T(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建：通过PCR克隆方法构建表达载体，使用引物C1orf194-F:5′-AGAGAATTCG GATCCATGCCTCCCACCCGGGACC-3′和C1orf194-R:5′-CTTCCATGGCTCGAGCTAGGTGGAGAAGAAG CCACC-3′分别扩增正常和携带Ile122Asn突变的人……