王 英，贝 宁，裴 华，杨 文，王华民

(1.海南医学院 病原生物学与免疫学实验室，海南 海口 571199； 2.海南医学院第二附属医院 检验科，海南 海口 570000； 3.海南省老年病医院 四科，海南 海口 571100)

假丝酵母菌(Candidaalbicans)是最常见的人类机会致病性真菌，容易引起妇女外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)，严重影响着女性的生殖健康和生活质量[1-2]，妊娠期合并VVC还可以增加不良妊娠结局的风险。抗真菌药物治疗虽有效，但耐药问题却日益突出，迫切需要寻找和研发新的抗真菌药物。红树林真菌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)生物学活性具有多样性[3-4]。

在红树林生态系统中，酵母菌群落相对于其他水域呈现出丰富的多样性，其合成的胞外多糖生物学活性可能同样具有多样性。在前期的红树林土壤微生物筛选研究工作中，我们分离到一株真菌PH1008，其产生的胞外多糖具有独特的生物学活性。通过构建小鼠VVC模型后，利用该胞外多糖进行阴道黏膜免疫干预，观察其通过阴道黏膜免疫后是否诱导小鼠机体引发预期的抗白假丝酵母菌感染效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物： SPF级，雌性，BALB/c品系小鼠，8～10周龄，体质量24～28 g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证书号：33920Q10866ROM)。

1.1.2 试剂和菌种： 胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)(本课题组从真菌PH1008发酵液中提取)；大豆粉玉米粉发酵培养液(本课题组制备)；苯甲酸雌二醇注射液(杭州动物药品厂)；沙氏培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；白假丝酵母菌ATCC10231(广东省微生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 EPS的提取： 无菌条件下，将真菌PH1008活化二代后，接种于大豆粉玉米粉发酵培养液中，5 d后取出，收集上清液，用链蛋白酶+Sevage联合法纯化获得EPS。

1.2.2 构建并干预小鼠VVC模型： 皮下注射含有0.1 mg苯甲酸雌二醇的油剂诱导BALB/c小鼠处于假发情状态。注射后第6天，将白假丝酵母菌5×107个孢子注入小鼠阴道内并倒置5 min(即10 μL浓度为5×1012个/L的白假丝酵母菌悬液)[5]。建模成功后分为VVC组(白假丝酵母菌感染组)和EPS组(EPS干预的白假丝酵母菌感染组)，每组15只。

1.2.3 EPS干预后基因表达谱的检测： EPS干预后第4天，取VVC组和EPS组小鼠，脱颈椎处死，分离阴道组织，切割近阴道壁厚度约1 mm的组织并存放于液氮保存，用于提取总RNA进行转录组基因表达水平检测。基因芯片检测采用Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray(4×44K)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 EPS干预BALB/c小鼠VVC模型

用EPS干预小鼠白假丝酵母菌感染模型后，小鼠外阴红肿、阴道充血等症状明显减轻，豆渣样分泌物减少(图1)，但阴道白假丝酵母菌的载菌量为(12.72±1.22) ×102CFU，相比VVC组的(13.62±1.77) ×102CFU无明显减少。

A.VVC mice before EPS intervention；B.VVC mice after EPS intervention图1 EPS干预前后小鼠VVC模型症状体征的改变Fig 1 Changes of symptoms and signs of VVC model before and after EPS intervention in mice

2.2 EPS干预后阴道组织基因表达谱

相比VVC组，EPS组小鼠阴道组织转录组基因表达水平改变超过2倍以上的基因共计55个，其中上调基因42个，下调基因13个(表1)。针对差异基因进一步做了信号通路分析，发现肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、补体1受体(complement 1 receptor, C1R)等基因在此时间点高水平表达与多个信号传导通路密切相关，主要涉及的通路包括：补体途径、IL-6信号通路、IL-10抗炎信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Jak-STAT信号通路、IL-17信号通路、细胞因子与炎性反应、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路，等等。

3 讨论

红树林的微生物群是新生物活性天然产物的丰富资源。大量研究显示真菌多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等生物学活性[6-9]。红树林的真菌产物对白假丝酵母菌具有一定的抗菌活性[10]。我们曾从红树林土壤中分离到的真菌PH1008，前期的实验结果显示其具有增强小鼠免疫功能活性。本次研究提取真菌PH1008发酵液中的EPS，并用其对小鼠VVC模型进行阴道局部黏膜免疫干预，发现小鼠阴道局部症状明显减轻，但是阴道局部白假丝酵母菌载量并没有因为EPS干预而发生明显改变，这一结果提示该EPS引发的抗感染效应可能与局部产生的免疫应答有关，其相关机制值得进一步探讨。目前阴道黏膜局部免疫应答和假丝酵母菌属真菌之间的相互关系并未完全明确。感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的女性群体VVC感染发病率高于没有感染HIV的妇女，这些女性群体接受抗反转录病毒治疗后，可提升机体CD4+T细胞表达水平，VVC感染率也随之有所降低。有观点认为，在VVC发病过程中，Th1细胞介导的免疫应答功能紊乱及后续导致多种固有免疫应答细胞,如中性粒细胞、巨噬细胞的过度参与往往不利于改善VVC炎性反应[11]。有研究认为局部Th1细胞免疫应答水平过强与VVC发生直接相关[12]。

表1 EPS组小鼠阴道组织转录组基因表达水平改变超过2倍以上的基因Table 1 Gene expression level of the transcriptome changed more than twice in EPS group

本研究收集经EPS干预后的小鼠阴道组织进行了基因表达水平检测并进行GO富集分析以及对差异基因进行信号通路分析，发现HGF、C1R等基因高水平表达与多个信号传导通路密切相关，这一结果推测可能与阴道局部感染、组织炎性损伤密切相关，其机制需要后续进行实验进一步明确。