刘月梅，张磊，赵二要，王静，董利利

肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)由肺炎支原体引起的一种肺部疾病，是儿童呼吸道感染最常见的病原体之一，通常大环内酯类抗生素即可有效治疗肺炎支原体，一旦经抗生素治疗7 d后病情仍未好转的患儿很有可能发展为难治性肺炎支原体肺炎(refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP)，表现为病情迁延不愈、肺部症状及胸部影像学进行性加重[1-2]。RMPP的发病机制目前尚未明确，研究者们认为与机体免疫反应过度表达、机体耐药性及细胞免疫介导的炎症反应是RMPP的主要发病机制。为充分了解RMPP患儿机体免疫变化，研究者收集患儿支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)观察T淋巴细胞亚群及细胞因子表达水平变化，可溶性共刺激分子B7-H3(solubleco-stimulatory molecule B7-H3，sB7-H3)参与外周免疫调节，与炎症反应关系密切，故本研究将其作为观察指标，分析RMPP患儿BALF中各因子表达水平。

1 对象与方法

1.1 研究对象 以2017年3月至2019年3月本院收治的RMPP患儿92例为观察组，按1∶2同期收集46例普通肺炎患儿为对照组。观察组中男52例，女40例；年龄3～14岁，平均(6.7±1.3)岁。对照组中男27例，女19例；年龄3～14岁，平均(6.5±1.2)岁。两组患儿在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》中相关诊断标准[3]。

1.3 纳入标准 (1)符合RMPP的诊断标准；(2)年龄3～14岁；(3)BALF中肺炎支原体DNA>1.0×104copies/mL；(4)应用大环内酯类抗生素治疗≥7 d肺部症状及胸部影像学持续进展；(5)患儿家属知情同意。

1.4 排除标准 (1)入组前2周内使用糖皮质激素；(2)痰培养显示细菌、真菌生长；(3)存在混合感染。

1.5 方法 进行支气管镜检查前评估患儿是否适合支气管镜检查，术前4 h嘱患儿禁食、禁水，术前30 min给予2%利多卡因进行局部麻醉。患儿进入支气管镜检查室后取平卧位，清理鼻腔，咪达唑仑针镇静，丁卡因胶浆涂抹镜管。支气管镜为BF-IT290(Olympus)型，经一侧鼻孔进镜，电子支气管镜到达病变部位时进行灌洗，对体质量≤20 kg患儿灌洗量为1 mL/kg，>20 kg患儿每次灌洗量为2 mL/kg，灌洗液总量≤10 mL/kg，将无菌痰液收集器连接于支气管镜操作孔道，负压抽吸获取灌洗液标本。负压范围如下：13.3～26.6 kPa(100～200 mm Hg)，每次灌洗液回收率≥40%、红细胞<20%且无大气道分泌物混入为合格标本。留取的灌洗液分装于离心管中，经离心处理后留取上清液，剩余标本置于-20 ℃冰箱内保存。如肺部病灶吸收不理想，1周后再次行支气管镜灌洗液收集。根据患儿急性期支气管镜下表现从黏膜、分泌物、管腔三方面分为2组。RMPP重度组表现为黏膜糜烂、小结节样凸起及坏死，大量黏液性分泌物，管腔变形或闭塞；RMPP轻度组表现为黏膜充血肿胀、纵行皱，大量浆液性分泌物。

1.6 观察指标 采用上转发光法检测BALF中白细胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、IL-6，试剂盒购自北京热景生物技术股份有限公司；采用双抗体夹心ELISA测定肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)，试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司，应用流式细胞仪(美国Becton Dickinson)检测BALF中T细胞亚群水平。采用双抗体夹心法检测sB7-H3，试剂盒购自上海一研生物科技有限公司。

2 结果

2.1 3组T细胞亚群水平比较 见表1。

表1 3组T细胞亚群水平比较

表1结果表明，RMPP重度组的CD3、CD4水平及CD4/CD8值均显著低于RMPP轻度组、对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，但RMPP重度组的CD8水平与RMPP轻度组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。RMPP轻度组CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3组细胞因子及sB7-H3表达情况比较 见表2。

表2 3组细胞因子水平及sB7-H3表达情况比较

表2结果表明，RMPP重度组IL-5、IL-6及TNF-ɑ水平均显著高于RMPP轻度组、对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，但RMPP重度组sB7-H3水平与RMPP轻度组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RMPP轻度组IL-5、IL-6及TNF-ɑ、sB7-H3水平均显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

RMPP的发生可能与肺炎支原体的耐药性、气道黏液高分泌等有关，经相关研究表明[4]，肺炎支原体可使淋巴细胞克隆活化导致细胞增殖，导致体内T细胞亚群比例失调，表现为CD4/CD8比例失衡，从而引起免疫功能紊乱，促进疾病发展。患儿在感染肺炎支原体后机体会产生TNF-ɑ、IL-6等促炎因子，以清除病原微生物[5]，IL-5对B细胞没有明显的刺激作用，其主要功能是刺激嗜酸性粒细胞增殖、分化及活化，与IL-6、TNF-ɑ、sB7-H3等参与机体的多种生理及病理反应[6]。因上述研究因子与机体MPP的发生有一定关联，因此临床可通过分析患儿肺泡灌洗液中的免疫因子及细胞因子判断病情变化。为充分分析不同严重程度患儿的各项因子水平变化，本研究以92例RMPP患儿为研究对象并分为2组，且以普通肺炎患儿为对照组，充分分析在不同疾病严重程度、非RMPP肺炎患儿中，CD3、CD4水平及CD4/CD8及相关细胞因子水平变化。结果显示，RMPP患儿的CD3、CD4水平及CD4/CD8值与对照组存在较大差异，RMPP重度组水平最低。研究者认为有以下因素：CD4细胞又称为辅助性T淋巴细胞，可促进B细胞、T细胞增殖、分化，发挥免疫效应功能[7-8]；CD8细胞又称为细胞毒性T淋巴细胞，可直接杀伤靶抗原，而T淋巴细胞除CD3分子外，其他分子的表面标志物及生物学功能不同，还会分出许多亚群，在机体感染肺炎支原体后，细胞增殖加快，T淋巴细胞亚群失调，表现为CD4/CD8比例失衡[9-10]。因此研究者认为，T淋巴细胞亚群及相关细胞因子在肺炎支原体感染疾病中的关键作用。在比较不同组的细胞因子水平及sB7-H3表达情况，RMPP重度组IL-5、IL-6及TNF-ɑ水平及sB7-H3均显著高于对照组，分析原因，应与sB7-H3在健康者体内表达量较低有关。此外，sB7-H3为T细胞的辅助性刺激因子[11]，但目前对其调控Th细胞分化并未有统一意见，有研究表示，sB7-H3可刺激T细胞，同时也可抑制T细胞，尽管正常机体中该因子含量较少，一旦在机体发生感染后其水平明显升高，尤其是呼吸系统疾病[12-13]。因此肺炎支原体感染患儿的sB7-H3显著高于对照组，但与疾病严重程度并无明显联系，研究者猜想，在后期的研究中或许可以利用sB7-H3表达判断是否为肺炎支原体感染。

综上所述，RMPP患儿BALF中T淋巴细胞亚群及炎性相关因子表达与症状有一定联系，随着病情的加重，炎性因子IL-5、IL-6、TNF-ɑ增高，sB7-H3可能参与机体免疫机制及炎性反应。下次研究应选取大样本进一步分析影响疾病进展的因素，并深入探讨不同因子在评估RMPP的预后效能，为临床治疗提供参考。