吴俊静，乔 木，周佳伟，梅书棋，彭先文

(动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病。PRRSV具有严格的宿主和细胞嗜性，入侵宿主细胞依赖细胞特异性受体，如CD163[1]。PRRSV只感染猪，不感染其他物种，且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞，尤其是猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAM)。在体外，PRRSV可在PAM、PK-CD163、Marc-145等细胞中增殖[2]。由于PRRSV具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征，目前疫苗控制效果并不理想。虽然，近年来国内外学者通过敲除CD163基因关键序列成功获得了抗PRRS的基因编辑猪[3-4]，但是其产业化的道路还不明朗。因此，亟待寻找防治PRRS新药设计的靶分子、研发有效的新型防治技术、培育抗病新品种。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、缺少特异完整的开放阅读框、没有或很少有蛋白编码功能的RNA分子，这类RNA广泛参与基因转录调控和表观遗传学调控，包括调控甲基化、染色质重塑、基因印记和计量补偿等功能[5]。由于lncRNA的表达谱具有较强的细胞类型特异性、组织特异性、发育阶段特异性等，因此可作为疾病诊断的生物标志物，更容易被利用开发为精准药物。已有研究表明，lncRNA在免疫和宿主对病毒感染的应答中发挥作用[6]。病原可能利用lncRNA能控制基因转录过程的特性而劫持宿主细胞[7]。然而，相对于mRNA和miRNA而言，有关lncRNA在PRRSV感染过程中的作用及机制的研究报道较少。

前期研究利用高通量测序技术分析了PAMs在感染PRRSV前后全转录组变化差异[8]，发现一种猪新lncRNA，命名为猪lnc-000649，其在PRRSV感染后显著下调表达。本研究通过构建猪lnc-000649的超表达载体，在细胞水平进一步分析了该lncRNA在PRRSV感染增殖中的作用，以期望获得防治PRRS药物研发的新设计靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞分离培养

PAM细胞的原代培养，采用4～5周龄左右的健康大白猪(PRRSV等各病原检测阴性)，在干净无菌的环境中取全肺，用PBS缓冲液(加1%青霉素和链霉素)分批次缓慢灌入肺中(大约400～500 mL)，每次对灌满的肺进行肺部按摩，并用吸管轻轻吹打，使其细胞团及黏液块打散，用无菌纱布过滤收集灌洗液，1 600 ×g离心10 min收集细胞。收集的细胞用RPMI 1640培养液(加1%青霉素和链霉素)进行洗涤，1 600 ×g离心10 min；重复洗涤1～2次。将洗涤好的细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬后，于10 cm培养皿中培养，37 ℃，5%的CO2培养2 h。除去未贴壁的细胞，余下细胞即可消化传入6孔细胞培养板中进行后续试验。分离的细胞用细胞冻存液重悬细胞，分装冻存。

Marc-145细胞系来源于华中农业大学，用含10%胎牛血清的DMEM培养基(葡萄糖含量不低于4 500 mg·L-1)于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.2 PAM细胞总RNA抽提

利用TRIzol、氯仿法提取PAM细胞总RNA。使用NanoDrop 1000微量分光光度计检测RNA样品浓度与D值，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.3 猪lnc-000649全长序列片段扩增及鉴定

取1 μg的总RNA样本，利用Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒，参照试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。用无RNAase去离子水将反转录所得cDNA稀释5倍后作为PCR反应模板。PCR扩增获得猪lnc-000649全长序列片段。PCR引物对：5′-GGCGAGGAAGTGCTGATG-3′和5′-TATGATGGTTCCCAGGCT-3′。PCR退火温度为55 ℃，延伸时间为90 s。PCR产物送武汉擎科创新生物科技有限公司测序。

1.4 猪lnc-00649超表达载体构建

以PAM细胞的cDNA为模板，利用引物对5′-CAAGCTTGGCGAGGAAGTGCTGATG -3′和5′-CTCTAGATATGATGGTTCCCAGGCT-3′，PCR扩增获得包含HindⅢ和XbaⅠ酶切位点的猪lnc-000649全长序列片段。然后，利用内切酶HindⅢ和XbaⅠ对PCR产物和骨架载体pcDNA3.1(+)载体(购自Invitrogen公司)分别进行双酶切。酶切反应体系为50 μL，于37 ℃酶切2 h。随后对酶切产物进行纯化回收，利用T4 DNA Ligase于16 ℃过夜连接。再将连接产物转入感受态细胞，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定并送武汉擎科创新生物科技有限公司对插入序列进行测序。测序正确的阳性克隆用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini KitⅠSpin)抽提重组载体DNA并测定浓度，命名为lnc-000649-pcDNA3.1。同时，用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶进行双酶切该载体，再次验证插入片段正确性。

1.5 细胞转染与PRRSV感染

在6孔细胞培养板中，每孔接种细胞数5×106个，利用Thermo公司的脂质体转染试剂Lipofectamine 3000分别将构建的猪lnc-000649超表达载体lnc-000649-pcDNA3.1和空载体pcDNA3.1(+)转入PAM或Marc-145细胞。转染细胞分为3组：A，转染pcDNA3.1(+)(空载体组)；B，转染lnc-000649-pcDNA3.1载体；C，不转染任何载体(空白对照组)；重复3次。

各转染组转染细胞24 h后，用0.5 MOI剂量的PRRSV-WUH3毒株感染细胞，细胞培养液换为含2%胎牛血清的RPMI 1640培养液(PAM细胞)或DMEM培养基(Marc-145细胞)。PAM细胞感染后24 h收集细胞，利用Trizol消化细胞，提取细胞总RNA后用于PRRSV RNA的荧光定量PCR检测。Marc-145细胞感染36 h后，反复冻融3次收集毒液，用于病毒滴度的检测。

1.6 猪lnc-000649与PRRSV RNA的荧光定量PCR检测

以PAM细胞的cDNA为模板，利用表1引物序列、TaKaRa公司THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix试剂盒，配制荧光定量PCR反应体系(20 μL)：qPCR mix 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，cDNA模板1 μL，灭菌双蒸水8 μL。利用Roche公司LightCycler480荧光定量PCR仪，进行荧光定量PCR实验。以β-actin作为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复3次。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循环40次。

表1 荧光定量PCR引物信息表Table 1 Information of the qPCR primers

1.7 PRRSV病毒滴度检测

将病毒原液使用DMEM培养基倍比稀释8个梯度后，加入预先铺有Marc-145细胞的96孔板中，每个梯度做8个重复孔，同时设立不接毒的对照组，放入细胞培养箱孵育96 h，观察细胞病变孔数，用Karber法计算TCID50。

2 结果与分析

2.1 猪lnc-000649在PAM细胞中表达情况

在PAM细胞中，利用荧光定量PCR的方法检测了猪lnc-000649在PRRSV感染前后的PAM细胞中的表达水平，证实猪lnc-000649在PAM细胞中表达，且在PRRSV感染组中表达显著下调(图1)。

2.2 猪lnc-000649超表达载体构建

根据全转录组高通量测序获得的猪lnc-000649序列设计引物，PCR扩增获得1 483 bp条带(图2)，并将PCR产物回收测序后发现与预期的猪lnc-000649序列完全一致。再次证明猪lnc-000649在PAM细胞中确实存在。为了进一步研究猪lnc-000649的功能，我们将猪lnc-000649全长序列插入pcDNA3.1(+)载体中，成功构建了猪lnc-000649超表达载体lnc-000649-pcDNA3.1。经Sanger测序以及HindⅢ和XbaⅠ双酶鉴定(图3)结果显示，插入片段正确。

2.3 猪lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

在PAM细胞中，利用脂质体转染构建的猪lnc-000649超表达载体lnc-000649-pcDNA3.1，以分析猪lnc-000649对PRRSV在细胞感染增殖的影响。结果发现，与转染pcDNA3.1(+)空载体的PAM细胞相比，转染lnc-000649-pcDNA3.1载体的PAM细胞中猪lnc-000649表达水平上调了5 214倍(图4)，说明成功构建了猪lnc-000649超表达细胞模型。在此基础上，PRRSV分别感染了猪lnc-000649超表达PAM细胞与对照细胞，采用实时荧光定量PCR技术检测了PRRSV感染24 h后细胞内病毒RNA的含量，结果表明，在超表达猪lnc-000649的PAM细胞中PRRSV RNA水平极显著(P<0.01)低于转染pcDNA3.1(+)空载体组及未处理组细胞(图5)。同时，在Marc-145细胞中发现超表达lnc-000649组的PRRSV病毒滴度(TCID50)显著(P<0.01)低于对照组细胞(图6)。以上结果表明，超表达猪lnc-000649对PRRSV增殖具有抑制作用。

3 讨论

lncRNA广泛存在于动植物中，物种之间保守性低，它们曾长期被误认为是遗传“暗物质”，但近些年研究证实这类RNA是广泛存在于细胞活动中的一类新型调节因子。目前已发现lncRNA具有多种功能，可以调控甲基化[9]、染色质重塑[10]、选择性剪接[5]、印迹和剂量补偿[11]。这些能调控基因表达的作用，使其在各种生物过程中发挥广泛作用。例如，lncRNAHOTAIR参与新陈代谢调控[12]；lncRNAXIST参与X-染色体印记调控[13]；lncRNAAirn参与发育调控[14]；lncRNAHOTTIP与干细胞多能性相关[15]。lncRNA作用机制复杂多样，有的lncRNA是作为信号分子，可在空间和时间上调控转录因子或信号通路的关键信号基因；有的lncRNA作为诱饵分子，与染色质中的转录因子和其他蛋白质结合，或作为miRNA靶点的诱饵；有的lncRNA作为引导分子，招募染色质修饰酶靶向目标基因，或以顺式或反式作用靶向某一特定基因；还有的lncRNA作为支架分子，将多种蛋白质聚集在一起形成核糖核蛋白复合物发挥特定生物活性功能[16]。然而，大多数lncRNA调控基因表达的方式及具体作用机制尚不清楚，还有更多的具有功能lncRNA有待发掘。

较多研究表明，lncRNA在免疫和宿主对病毒感染的应答中发挥作用[6-7]。Ouyang等[17]报道，位于细胞质或细胞核的lncRNA可通过调控转录因子活性，参与调节细胞因子或抗病毒基因(如干扰素刺激基因)的转录；lncRNANEAT1能介导未剪接人类免疫缺陷病毒(HIV)转录本的转录后调控抑制HIV的复制[18]；lncRNANRAV可抑制干扰素刺激基因的表达而影响流感病毒的复制以及宿主免疫[19]；lncRNALethe既可以负调控NF-κB调节炎症反应，又能抑制Ⅰ型干扰素介导的免疫应答，进一步促进丙肝病毒的复制[20-21]。lncRNA是否也参与PRRSV感染后的免疫应答过程，国内外这方面研究相对较少。陈曦[22]发现，lncRNAALDB4471参与宿主对PRRSV的免疫应答；甘利鹏等[23]发现，lncRNATCONS_00179042显著抑制PRRSV在Marc-145细胞中感染增殖，且PRRSV感染后导致该lncRNA下调表达，从而有利于病毒自身的复制。

本研究发现，PAM细胞中存在一种新的长链非编码RNA，命名为lnc-000649，在PRRSV感染后下调表达，且在PAM细胞中超表达猪lnc-000649后可以显著抑制细胞内PRRSV RNA的含量。同时，在Marc-145细胞中超表达猪lnc-000649后也可以显著抑制病毒增殖，说明猪lnc-000649具有抑制PRRSV感染增殖的效果。为了进一步分析猪lnc-000649影响PRRSV感染增殖的潜在机制，预测了其可能的共定位和共表达靶基因情况。猪lnc-000649的共定位基因仅发现ARNT2基因，位于其下游94 314 bp处。然而，ARNT2基因主要报道与下丘脑-垂体轴发育、出生后脑生长、视觉和肾功能发育，以及癌症发生相关[24]。根据全转录组测序结果，预测获得了195个猪lnc-000649的共表达基因(皮尔森相关系数绝对值>0.95)，其中包括IRF7、ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT3、IFIT5、RSAD2、MX1、GBP1等与免疫或PRRSV感染相关基因。研究哺乳动物发现，在病毒入侵时会激活干扰素天然免疫信号，诱导宿主产生抗病毒状态，其通过激活数百个干扰素刺激基因发挥抗病毒和免疫调节的生物学效应[25]。IRF7编码干扰素调节因子7，在病毒诱导的细胞基因转录激活中发挥作用[26]；ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT3和IFIT5是干扰素诱导蛋白，均具有抗病毒效应[25，27]。研究表明，PRRSV可通过干扰IRF7活性来抵消Ⅰ型干扰素诱导的早期抗病毒状态[26]；ISG20超表达能显著抑制PRRSV增殖[28]；RSAD2可以通过阻断早期病毒基因组复制和转录来抑制病毒增殖[29]。同时，MX1与GBP1也是重要的抗病毒分子[27]，且与猪对PRRSV病毒的抵抗和T细胞的有效激活显著相关[30]。因此，猪lnc-000649可能通过这些潜在的靶基因来影响PRRSV增殖。另一方面，根据所获得的猪lnc-000649序列，利用miRDate (v3.3a)预测了其可能存在靶向作用的miRNA，发现猪lnc-000649序列上存在miR-125、miR-30、miR-23、miR-29、miR-10等miRNA的作用靶点。而以上这些miRNA均报道参与调控PRRSV感染增殖过程[31-34]。lnc-000649也有可能与这些miRNA的靶基因竞争性结合，从而参与调控PRRSV感染增殖。然而lnc-000649具体机制还有待进一步深入研究。