樊利虹，郭红瑞，吴 江，易 军，马晓平，苟丽萍，谢 跃，叶 刚，左之才，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 温江 611130；2.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

供试的5株皮特不动杆菌分别于2018年7月分离自四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7菌株)、宜宾(ZZCJL1807-8菌株)、什邡(ZZCSF1807-9菌株)发生BRDC的肉牛鼻拭子。发病牛临床表现为体温升高(达41 ℃)，流鼻液，呼吸困难，口有泡沫，部分牛有口腔溃疡等症状，但蹄部、关节等无异常，有环丙沙星、阿莫西林、青霉素、头孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板蓝根等用药史，但病情总是反复。

1.1.2 主要试剂与配置

营养肉汤(NB)、革兰氏染色液、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色剂，购自北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司；PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.4)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；BM 2000+DNA marker、2×TaqPCR MasterMix，购自北京博迈德生物技术有限公司。

普通营养琼脂培养基(NA)：分别称取1.8 g NB、1.5 g琼脂粉，加100 mL双蒸水(ddH2O)，高压蒸汽灭菌后使用。

4%多聚甲醛：称取多聚甲醛40 g，加PBS磷酸盐缓冲液500 mL，置于50 ℃水浴锅加热搅拌至完全溶解，待冷却后加PBS磷酸盐缓冲液定容至1 000 mL，最后调节pH值至7.4左右。

1.1.3 试验动物

选用健康的4～5周龄、体重18～20 g的雄性SPF级昆明小鼠78只作为试验对象。试验动物均购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 毒力基因检测

将5株皮特不动杆菌分别接种于TSB中，37 ℃培养24 h后，按照细菌基因组提取试剂盒的说明书提取基因组DNA。……