沈植国，孙 萌，丁 鑫，程建明，陈迪新

(1.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004；2.河南省林业科学研究院，河南 郑州 450008；3.河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023)

蜡梅[Chimonanthuspraecox(L.) Link]是蜡梅科蜡梅属落叶灌木，是中国传统的名贵观赏花木，有较高的观赏价值、药用价值，以及深刻的文化内涵，有很强的开发推广价值。近年来，关于蜡梅的研究很多，但主要集中在种质资源调查[1]、药效物质和化学成分[2-3]、品种分类，以及品种、品系生物学特性等方面[4-7]。由于蜡梅花期的特殊性，加上花粉活力可能较低或是目前还未找到合适的培养基，花粉萌发率和花粉管生长情况都不理想；而且关于蜡梅花粉萌发和花粉管生长的研究报道较少[8]。蜡梅主要分为素心、乔种、红心3大类型，关于3种类型花粉的全面系统研究尚未见报道，目前已有的研究结论仅局限于蜡梅物种，还没有具体到某一个类型或品系[9-10]。已有研究表明，蜡梅同一朵花内的雌雄蕊在时间和空间上有花期不遇的现象，其繁育系统为兼性异交型，有一定的自交比例，但需传粉媒介[8]。因此，掌握不同品系蜡梅花粉的萌发和生长特性，为指导生产中合理配置授粉品种、促进蜡梅开花结实和品种选育有重要意义。由于我国不同品种、不同地域间蜡梅花期间隔多数为30 d左右，本研究以-20 ℃下贮藏30 d的素心、乔种、红心3个类型5个品系的花粉为材料，采用能够直观、精确地反映花粉活力的离体萌发法[11-12]，系统研究不同培养基成分对不同类型蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响，旨在筛选出适宜不同类型蜡梅花粉萌发的培养基，为指导生产实践中科学授粉和杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本次试验所用的蜡梅花采于河南省许昌市魏都区。豫素1号、豫素2号品系为素心类型，豫乔1号、豫乔2号品系为乔种类型，豫红1号品系为红心类型。花粉收集处理参考张绍铃等[12]的方法。

1.2 方法

前期试验培养基成分统一为10 mg·L-1H3BO3+10 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O+250 g·L-1PEG-4000[13]。采用单因素试验分别研究PEG-4000、蔗糖、H3BO3、Ca(NO3)2·4H2O对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响。采用液体培养基培养花粉，参照王友保等[14]的方法略作修改。试验分别设置以下处理，以不加该物质作为对照，PEG-4000的浓度分别为0、150、200、250、300 g·L-1，蔗糖的浓度分别为0%、2.5%、5%、7.5%、10%，H3BO3的浓度分别为0、5、10、15、20 mg·L-1，Ca(NO3)2·4H2O的浓度分别为0、5、10、15、20 mg·L-1。每个处理重复3次。

在上述试验的基础上，采取三因素五水平正交试验，研究不同化合物共同作用对花粉活力的影响。试验设计见表1。

试验中将一片双层湿滤纸放入培养皿中保湿，每6 h加1次蒸馏水，将凹槽载玻片放入培养皿中，然后将配好的培养液用胶头滴管滴至载玻片凹槽处，从冰箱中取出花粉，然后用镊子在硫酸纸上刮下少量花粉，将花粉抖在培养液上，盖上培养皿，然后在15 ℃培养箱中培养48 h后观察。

1.3 花粉萌发率测定

花粉培养48 h后，将载玻片从培养箱中取出，在光学显微镜下观察(NOVEL XS-212南京江南永新)。花粉管长度大于花粉粒直径(平均直径为98.50 μm)视为萌发。在光学显微镜同一个视野中记录萌发和未萌发的花粉数量，计算萌发率。每次处理重复3次，每个重复观察5个视野，每个视野观察花粉粒不少于30个。

花粉萌发率(%)=萌发的花粉数÷总花粉数×100。

1.4 花粉管长度测量

取长势清晰的萌发花粉在显微镜下观察，用测微尺随机测量花粉管长度。每个视野测量花粉管数量不少于30个，计算平均值。

1.5 数据处理

采用Duncan新复极差法进行数据分析、方差分析和多重比较。所用数据分析软件为SPSS 20.0和Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 蔗糖对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响

由图1可知，当蔗糖浓度为0时，花粉萌发，花粉管生长正常；除豫乔1号(在浓度5%时萌发率达到最高，为18.94%)外，萌发率和花粉管长度均最大，豫素1号、豫素2号、豫乔2号、豫红1号的萌发率分别为20.12%、19.58%、18.46%、18.57%；豫素1号、豫素2号、豫乔1号、豫乔2号、豫红1号的花粉管长度分别为211.54、206.67、201.47、194.14、193.89 μm。随着蔗糖浓度的升高，2个乔种蜡梅在蔗糖浓度5%时萌发率有所提升，其他3种蜡梅萌发率均呈下降趋势，当蔗糖浓度高于5%时，5种蜡梅花粉萌发率均明显下降；随着蔗糖浓度的升高，5种蜡梅花粉管长度均逐渐变短。表明蔗糖在培养基中对腊梅花粉萌发不起决定性作用，高浓度蔗糖会抑制蜡梅花粉的萌发。

2.2 聚乙二醇(PEG-4000)对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响

从图2中可以看出，对照组中花粉均未萌发，说明PEG-4000是这5种蜡梅花粉离体培养所必需的培养基组分。随着培养基中PEG-4000浓度的增加，5种花粉萌发率显著升高，花粉管长度显著增加，当PEG-4000浓度达到250 g·L-1时，5种蜡梅的萌发率均达到最大值，豫素1号、豫素2号、豫乔1号、豫乔2号、豫红1号的花粉萌发率分别为32.01%、30.21%、27.31%、29.81%、27.59%；当PEG-4000浓度达到300 g·L-1时，这5种蜡梅的花粉萌发率分别下降至28.71%、28.57%、23.92%、29.62%和26.53%，说明高浓度PEG-4000对这5种蜡梅花粉萌发均有抑制作用。不同浓度PEG-4000对这5种蜡梅花粉管生长的影响和对花粉萌发的影响相似，当PEG-4000小于250 g·L-1时，花粉管长度随着PEG-4000浓度的增加而增大，当PEG-4000为250 g·L-1时，豫素1号、豫素2号、豫乔1号、豫乔2号和豫红1号的花粉管长度达到最大值，分别为272.18、268.81、279.21、250.34、230.86 μm，超过该浓度后，各蜡梅品系花粉管长度均下降。当PEG-4000为250 g·L-1时，花粉萌发率最高的品种为豫素1号，花粉管最长的品系却为豫乔1号，其他浓度时这种差异有时也存在。综上，PEG-4000为150～300 g·L-1时，可促进不同品系蜡梅花粉萌发，且在250 g·L-1时效果显著好于其他浓度处理。

2.3 硼酸对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响

由图3可知，在一定浓度范围内，5个品系蜡梅花粉的萌发率和花粉管长度均随着培养基硼酸浓度的升高而增加。当硼酸浓度为10 mg·L-1时，5个品系蜡梅花粉萌发率和花粉管长度均达到最大值，豫素1号、豫素2号、豫乔1号、豫乔2号和豫红1号花粉萌发率分别为26.32%、25.94%、26.97%、26.47%、23.91%，分别是各自对照组的3.15倍、3.16倍、3.67倍、3.58倍和2.47倍；这5个品系的花粉管长度分别为238.96 μm、244.28 μm、233.14 μm、224.44 μm和259.65 μm，分别是各自对照组的1.56倍、1.69倍、1.69倍、1.67倍和1.87倍。当硼酸浓度高于10 mg·L-1时，5个品系的蜡梅花粉萌发和花粉管生长受到明显抑制但仍高于对照组。整体变化趋势表明，低浓度促进作用大于高浓度的抑制作用，且不同品系的萌发率和花粉管长度受硼酸的影响程度不完全一致。总体上，一定浓度的硼酸(10 mg·L-1)能促进蜡梅花粉萌发和花粉管生长。

2.4 硝酸钙对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响

由图4可知，5个品系蜡梅对钙的反应与硼酸一致，先随着培养基内硝酸钙浓度的升高而增加；当硝酸钙浓度为10 mg·L-1时，5个品系蜡梅花粉萌发率和花粉管长度达到最大值，豫素1号、豫素2号、豫乔1号、豫乔2号和豫红1号花粉萌发率分别为26.57%、27.34%、23.45%、24.15%和24.86%，花粉管长度分别为224.33 μm、218.75 μm、199.77 μm、187.21 μm和209.65 μm；当硝酸钙浓度高于15 mg·L-1时，蜡梅花粉萌发和花粉管长度受到抑制，但大部分仍高于对照组(豫乔2号除外)。不同浓度对比，可以看出不同品系均表现为高浓度抑制作用较低浓度促进作用小。说明一定浓度的硝酸钙(10 mg·L-1)能促进蜡梅花粉萌发和花粉管生长，浓度过高反而抑制蜡梅花粉萌发和花粉管生长。

2.5 最佳培养基成分选择

通过单因子试验可以看出，PEG-4000、硼酸、硝酸钙这3种物质都能在不同程度上促进蜡梅花粉萌发和花粉管的生长，而添加蔗糖却不利于花粉管生长。在正交试验中只考虑对花粉萌发有利的因素，目的是找出硼酸、硝酸钙、PEG-4000的最佳组合来配置培养基。由表1可知，当PEG-4000为250 g·L-1，硝酸钙浓度为10 mg·L-1，硼酸浓度为20 mg·L-1时，豫素1号、豫素2号和豫红1号花粉萌发率最高，分别为25.38%、25.34%和23.46%；此时它们的花粉管长度最长，分别达到302.31 μm、297.64 μm和285.68 μm。因此，素心和红心类蜡梅花粉最佳培养基的组成为：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸钙 10 mg·L-1+硼酸20 mg·L-1。此时，PEG-4000和硝酸钙浓度也是单因素试验中的最佳浓度，但硼酸浓度却高于单因素试验的浓度。

表1 正交试验中各组合蜡梅的花粉萌发率和花粉管长度Table 1 Pollen germination rate and pollen tube length of different Chimonanthus praecox strains in different combination in orthogonal test

续表1 Continued Table 1

当PEG-4000浓度为250 g·L-1，硝酸钙浓度为5 mg·L-1，硼酸浓度为15 mg·L-1时，豫乔1号和豫乔2号花粉萌发率最高，达到了24.43%和24.93%，花粉管长度最长，达到了288.27 μm和286.37 μm。因此，乔种蜡梅最佳培养基的组成为：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸钙5 mg·L-1+硼酸15 mg·L-1。此时，PEG-4000也是单因素试验中的最佳浓度，硼酸浓度高于单因素试验的最佳浓度，而硝酸钙浓度却低于单因素试验的最佳浓度。

由表2方差分析结果可知，PEG-4000对蜡梅花粉萌发和花粉管长度影响比较大，不同浓度之间差异显著，硼酸和硝酸钙的影响比PEG-4000小，不同浓度之间差异不显著。

表2 正交试验中PEG、H3BO3、Ca(NO3)2处理经SPSS软件主效应分析的均方(MS)、F值与R2Table 2 Mean square (MS)，F value and R2 of PEG，H3BO3 and Ca (NO3)2 in orthogonal test by SPSS software

3 结论与讨论

本研究表明，PEG-4000是蜡梅花粉萌发和花粉管生长的必需成分，硼酸和硝酸钙对其影响较PEG-4000小，但也有一定的辅助作用，一定浓度的蔗糖会抑制蜡梅花粉萌发和花粉管生长。素心和红心类蜡梅花粉萌发最佳培养基为PEG-4000 250 g·L-1+硝酸钙10 mg·L-1+硼酸20 mg·L-1。乔种蜡梅花粉萌发最佳培养基的配方为：PEG-4000 250 g·L-1+硝酸钙5 mg·L-1+硼酸15 mg·L-1。素心类型蜡梅的花粉萌发和生长情况较好，更适宜作为授粉用花粉。

花粉中以淀粉为主的内源性糖能够为花粉萌发提供能量来源，外源性糖比内源性糖的作用显著[11]。研究表明，蔗糖是很多植物花粉离体萌发和生长所必需的营养成分[10，15-17]。但在本试验中，添加蔗糖时，花粉萌发和花粉管生长受到明显抑制，且浓度越高，花粉萌发和生长所受到的抑制作用越明显，不添加蔗糖的培养基反而更适合蜡梅花粉的萌发和花粉管伸长，这与龚双姣等[10]和赵宏波等[18]的研究结果一致，但与郭娟等[17]和胡珂雪等[19]的研究结果相反。这可能与物种有一定的关系，研究结果与本文一致的都是蜡梅，而研究结果与本文相反的分别为冬青属植物和四季报春。

在本研究中，5个品系蜡梅花粉在没有PEG-4000的培养基上均不萌发，当添加一定量的PEG-4000后，花粉萌发率逐渐升高，花粉管长度逐渐变长，表明PEG-4000对素心、乔种和红心3种类型蜡梅的花粉萌发和花粉管伸长有促进作用，这与龚双姣等[10]、赵宏波等[18]、王四清等[20]的研究结果一致。郭娟等[17]、胡珂雪等[19]在没有使用PEG时，花粉也能够萌发和生长，这个可能与物种或该物种本身含有特殊功能物质有关，值得进一步探讨。

硼酸主要参与花粉管顶端细胞壁的构建，影响花粉管的生长，钙离子使花粉管壁的可塑性降低，且具有相当硬度[17，20]。大多数植物花粉萌发需要额外添加一定量的钙，除非大量花粉聚集在一起而产生群体效应。一般情况下，花粉自身所含的硼离子和钙离子是不足的，需要在培养基中添加一定量的硼和钙来促进花粉的萌发和生长，不同种类植物花粉萌发和生长所需的硼和钙浓度存在一定的差异[21-24]，种内或品系间差异一般较小。正交试验中，5个品系蜡梅花粉在相同条件下所受硼酸和硝酸钙的影响无明显差异，但物种间有差异。相对于大花蕙兰，蜡梅品系花粉萌发所需钙浓度较低，而所需硼酸浓度无差异；相对于猕猴桃，蜡梅品系花粉萌发所需硼酸浓度较低，但所需钙浓度无差异[25-26]，具体原因有待进一步探讨。