潘显茂 郑英换 李兰婷 孔海洁 吴佳颖

摘要 [目的]初步筛查海南狗牙花抗肿瘤活性部位。[方法]采用MTT比色法测定海南狗牙花4种提取物分别对人非小细胞肺癌细胞（A549）和人乳腺癌细胞（MCF-7）体外生长抑制作用。[结果]海南狗牙花4种提取物对2种肿瘤细胞呈现不同的抑制活性，乙酸乙酯提取物的抗肿瘤活性最强，石油醚提取物次之，正丁醇萃取物较弱而萃取后的水层无抗肿瘤活性。[结论]该研究为深入研究海南狗牙花中具有抗肿瘤活性的单体化合物提供科学依据。

关键词 海南狗牙花;提取物;抗肿瘤活性;MTT比色法

中图分类号 R284;R285 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）01-0160-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.043

Abstract [Objective]To initially screen the anti-tumor active parts of Ervatamia hainanensis.[Method]MTT colourometry was used to determine the inhibitory effect of four extracts of Ervatamia hainanensis on A549 and MCF-7 human tumor cells in vitro.[Result]The four extracts of Ervatamia hainanensis showed different inhibitory activities on two kinds of tumor cells， the anti-tumor activity of the ethyl acetate extract was the strongest， the petroleum ether was the second， the n-butanol extract was weak， and the aqueous layer after the extraction had no anti-tumor activity.[Conclusion]This research provides scientific basis for the in-depth study of the monomeric compounds with anti-tumor activity in Ervatamia hainanensis.

Key words Ervatamia hainanensis;Extractive;Anti-tumor activity;MTT colourometry

海南狗牙花（Ervatamia hainanensis Tsiang），夹竹桃科狗牙花属灌木，又名单根木，主要分布在我国云南、广西、海南等地区，是一种民间中草药。海南狗牙花，味苦、辛，性凉，主治清热解毒、降血压、降血脂、消肿止痛，治疗腹痛和咽喉肿痛等[1]。现代研究表明，海南狗牙花中含有生物碱、三萜类、木质素、甾醇等多种化学成分，有不少研究发现，狗牙花提取物中还含有抗肿瘤活性成分，显示出对某些癌细胞具有抑制作用[2-9]。该研究将海南狗牙花根茎进行充分提取并分离出乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物和萃取后的水层4种组分，将这4种组分分别作为药物给予，作用于人乳腺管癌细胞MCF-7和人非小细胞肺癌细胞A549，采用MTT检测法进行药物毒性试验，初步研究其抗肿瘤活性，为深入研究海南狗牙花中具有抗肿瘤活性的单体化合物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器。分析天平（BSA124S-CW，賽多利斯）;二氧化碳培养箱（BPN-170RWP，上海一恒）;台式低速离心机（TD-5M，山东博科）;倒置相差显微镜（DM IL LED ，LEICA）;全自动细胞计数仪（Countess Ⅱ，Thermo Scientific）;酶标仪（F-50，TECAN）;微孔板恒温振荡器（YMB100-4A，上海熙扬）;智能数显恒温水浴锅（YRE-2020A，杭州亿捷科技）;减压旋转蒸发仪（Hei-VAP advantage，德国海道尔夫）。

1.1.2 试剂。高糖DMEM培养液、小牛血清、青霉素-链霉素溶液（1 000 IU/mL）、PBS、0.25% 胰酶消化液（含EDTA，酚红），均购置于GBIGO公司;噻唑蓝（MTT），购置于 SIGMA公司;二甲基亚砜（DMSO）、95% 乙醇、石油醚（I）、正丁醇、乙酸乙酯均为分析纯，购置于广州化学试剂厂。

1.1.3 药材。海南狗牙花采自海南省白沙黎族自治县鹦哥岭。经中国医学科学院药用植物研究所海南分所郑希龙博士鉴定。

1.1.4 细胞株。人非小细胞肺癌细胞（A549）、人乳腺癌细胞（MCF-7）均为贴壁细胞，并购置于北纳生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 海南狗牙花活性部位的提取。

取海南狗牙花干燥根茎1 kg，粉碎，95%乙醇静置提取，过滤除去药渣，滤液置减压蒸馏装置中，蒸馏得浸膏，浸膏使用蒸馏水分散后，用石油醚（Ⅰ）、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，得到海南狗牙花石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分和水层组分，均减压蒸干溶剂，得4组提取物，低温保存备用。

1.2.2 体外抗肿瘤试验方法。

1.2.2.1 试验分组及剂量设计。分别称取海南狗牙花石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后水层4种萃取物适量，加DMSO助溶使药物充分溶解于纯化水中，制成200 mg/mL的母液，经0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。临用前用含血清的细胞完全培养液梯度稀释至4 000、2 000、1 000、500、250 μg/mL进行MTT试验。此次MTT试验狗牙花每种提取物均设5个剂量组，最终浓度分别为400、200、100、50、25 μg/mL，每个剂量组均为6个复孔，试验同时设空白组（含细胞和等量完全培养液）和调零孔（不含细胞含等量完全培养液）。

1.2.2.2 A549细胞处理方法。

将处于对数生长期的细胞消化计数，用含有10%小牛血清的高糖DMED细胞完全培养液制成5.5×104个/mL的细胞悬液，按180 μL/孔接种于96孔细胞培养板中，置37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h。24 h后分别加入不同浓度的试验样品20 μL（空白组加20 μL完全培养液），置培养箱分别培养24和48 h后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态，弃去原培养液，PBS洗板1次，再加入100 μL无血清培养基和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，弃液，每孔加150 μL DMSO避光振荡（37 ℃）混匀10 min，使结晶完全溶解。

1.2.2.3 MCF-7细胞处理方法。

将处于对数生长期的细胞消化计数，用含有10%小牛血清的高糖DMED细胞完全培养液制成1.0×105个/mL的细胞悬液，按100 μL/孔接种于96孔细胞培养板中，置37 ℃，5%CO2培养箱培养。待96孔板中MCF-7细胞生长接近汇合后，弃去原培养液，每孔分别加入180 μL完全培养液和不同浓度的试验样品20 μL（空白组加200 μL完全培养液），置培养箱分别培养24和48 h后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态，弃去原培养液，PBS洗板1次，每孔分别加入100 μL无血清培养基和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，弃液，每孔加100 μL DMSO避光振荡（37 ℃）混匀10 min，使结晶完全溶解。

1.2.2.4 MTT试验结果检测和数据处理方法。

取上述处理完成的96孔试验板置酶标仪于492 nm波长处测定每孔吸光度（OD），然后按照下式进行药物对细胞生长抑制率的计算：细胞生长抑制率=[1-（样品组OD值-调零组OD值）/（空白组OD值-调零组OD值）]×100%[10]。试验数据用±S表示，采用SPSS 20.0对试验数据进行统计学处理，结合药物浓度推算半数抑制浓度IC50值。

2 结果与分析

2.1 海南狗牙花初步提取分离 取干燥海南狗牙花根茎1 kg，粉碎，用95%乙醇冷浸7 d，滤过，取滤液减压回流浓缩至无醇味，得总浸膏148 g，总浸膏用适量水混悬，滤过，用石油醚（Ⅰ）、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取3次，收集萃取溶剂，分别减压回流浓缩至干，得石油醚提取组分0.11 g、乙酸乙酯提取组分0.85 g、正丁醇提取组分1.74 g、水组分4.13 g。

2.2 海南狗牙花提取物对肿瘤细胞生长抑制的影响

从表1可以看出，海南狗牙花石油醚提取组分和乙酸乙酯提取组分对A549和MCF-7肿瘤细胞均有抑制作用，且随着浓度的增加，抑制作用增强。其中，海南狗牙花乙酸乙酯萃取物对MCF-7肿瘤细胞的抑制活性最强，且呈现良好的剂量-效应关系。在该试验研究条件下，当药物浓度达到400 μg/mL时，海南狗牙花正丁醇提取物和水提取物对A549和MCF-7肿瘤细胞无明显的抑制活性。

2.3 海南狗牙花提取物对肿瘤细胞的IC50值 从表2可以看出，海南狗牙花乙酸乙酯提取物对A549和MCF-7肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50值均低于石油醚提取物的IC50值，由此表明海南狗牙花乙酸乙酯部位的抗癌活性优于石油醚部位。海南狗牙花药物作用48 h时的 IC50值均低于24 h时的IC50值，说明随着作用时间的延长，其对肿瘤细胞的抑制作用越明显。

3 结论与讨论

海南狗牙花是我国南方特有的夹竹桃科狗牙花属植物，查阅相关文献发现海南狗牙花植物中富含生物碱，具有防治精神依赖和抗肿瘤等作用[2]。此次体外抗肿瘤活性试验结果表明，海南狗牙花4种提取组分中，石油醚提取组分和乙酸乙酯提取组分对癌细胞MCF-7和A549具有较强的抑制效果，其中乙酸乙酯提取组分抗癌活性优于石油醚组分且对MCF-7细胞的抑制活性最强，而正丁醇组分和水组分则没有抑制效果。海南狗牙花提取物对肿瘤细胞作用时间延长至48 h时，其石油醚组分和乙酸乙酯组分浓度在400 μg/mL时对抗癌细胞抑制效果明显，抑制率均达到80%以上，而在低浓度时抗癌细胞抑制效果较弱，这可能是与高浓度药物有利于通过被动转运进入细胞膜内且对细胞产生抑制作用有关。

后续将根据此次试验研究结果，对海南狗牙花提取物的抗肿瘤活性成分进一步分离纯化后，再进行更多瘤株的抑制活性筛选，为海南狗牙花抗肿瘤活性作用建立药效学基础，可用作为抗肿瘤药物研发的科学依据。

参考文献

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