陈敏氡 王彬 刘建汀 叶新如 曾美娟 朱海生 温庆放 康玉妹

摘要 [目的]通过CRISPR/Cas9系统构建丝瓜LcPPO1基因编辑载体。[方法]根据前期已经克隆得到的LcPPO1基因序列，设计2个sgRNA靶位点序列，退火制备sgRNA双链，分别与线性PCA1301-Cas9载体连接获得2个重组载体，将重组载体转化DH5α感受态细胞，再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]2个sgRNA靶位点序列已经分别准确地连入PCA1301-Cas9载体，插入序列无突变。[结论]成功构建了丝瓜LcPPO1基因编辑载体PCA1301-Cas9-sgRNA1和PCA1301-Cas9-sgRNA2，为后续研究丝瓜LcPPO1基因功能奠定了基础。

关键词 丝瓜;LcPPO1基因;CRISPR/Cas9技术;基因编辑

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）03-0105-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.028

Abstract [Objective]LcPPO1 gene editing vector for luffa was constructed by CRISPR/Cas9 system. [Method]Based on the sequence of LcPPO1 gene cloned in previous stage， two sgRNA target sequences were designed， and the sgRNA double strand was prepared by annealing.Then the sgRNA double strands were connected with the linear PCA1301Cas9 vector to obtain two recombinant vectors， respectively. The recombinant vectors were transformed into E.coli DH5α， and then identified by PCR and sequenced. [Result]Two sgRNA target sequences were accurately linked into the PCA1301Cas9 vector， respectively， and the insertion sequence had no mutation. [Conclusion]Two LcPPO1 gene editing vectors for luffa， PCA1301Cas9sgRNA1 and PCA1301Cas9sgRNA2， were successfully constructed， which laid a foundation for further study on the function of LcPPO1 gene in luffa.

Key words Luffa;LcPPO1 gene;CRISPR/Cas9 technique;Gene editing

絲瓜为葫芦科（Cucurbitaeeae）丝瓜属（Luffa Mill.）一年生攀援藤本植物，起源于印度，在东亚地区被广泛种植，我国各地也均有大面积栽培，是我国重要的蔬菜品种之一[1-2]。丝瓜主要有普通丝瓜[Luffa cylindrica（L.）Roem.]和有棱丝瓜[Luffa acutangula（L.）]两类栽培种，我国大部分地区以栽培普通丝瓜为主，仅广西、广东及海南省等华南地区种植有棱丝瓜[3]。普通丝瓜在储藏、运输、加工和烹饪过程中果肉和果汁容易产生褐变，极大降低了贮藏加工性能，严重影响丝瓜产品的营养品质和商品价值，造成了巨大的经济损失。阐明丝瓜褐变机理并控制褐变的发生已成为丝瓜育种及其采后贮藏保鲜的研究重点[3-6]。

研究发现，普通丝瓜的褐变属于酶促褐变，褐变的主要原因是细胞内酚类物质在多酚氧化酶（PPO）的催化下氧化形成醌，醌聚合形成黑色或褐色沉淀[7-8]。我国台湾的几个学者对丝瓜褐变的生理机制进行了探讨，证实丝瓜的褐变主要是PPO酶引起的酶促褐变，PPO酶的含量和活性与褐变具有直接关系[9-10]。……