潘婷钰 何海浪 周贤梅

南京中医药大学附属医院呼吸与危重症医学科210029

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性进行性疾病,以纤维化、呼吸困难、肺功能恶化和生活质量降低为特征[1]。患者确诊年龄通常在60岁以上[2],预后不佳；生存期中位数为3～4年,5年生存率为20%～40%[3]。呼吸衰竭是最常见的死亡原因[4]。IPF是由肺泡上皮细胞重复损伤、肌成纤维细胞不可控增殖、细胞外基质沉积等修复过程失调所致；然而,IPF的致病途径尚未完全阐明[5-6]。IPF的诊断可以基于病史和特殊的高分辨率CT表现,主要为双肺基底部胸膜下蜂窝影伴牵拉性支气管扩张。当高分辨率CT仅显示部分特征与IPF一致时,国际指南推荐外科肺活检[2,7]。侵入性手术对于呼吸道受损的患者有一定风险,因此迫切需要侵入性较小的方法来促进诊断、评估预后和监测治疗策略的有效性。

IPF导致体内病理生理过程变化,可引起代谢产物发生相应改变。代谢组学是研究生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后代谢组变化的科学,最常用技术是核磁共振和高分辨率质谱[8-9]。代谢组是指参与新陈代谢、维持生物体正常生长功能和生长发育的所有内源小分子(＜1 000),如氨基酸、肽、碳水化合物、脂类、核酸[10]。公共人类代谢组数据库已建立,目前列出了42 000种代谢物[11],部分内源性小分子化合物的生化代谢网络已经比较清楚。近年来,关于IPF代谢组学的研究报道逐渐增多。广泛的生物样本已用于肺部疾病代谢组学研究,包括尿液、血浆、血清、脑脊液、呼气冷凝液、支气管肺泡灌洗液、唾液、完整组织、细胞及其提取物[12]。这些为IPF发病机制的研究、生物标志物的筛选及药物作用靶点的发现提供了新的研究工具,使临床医师将代谢组学作为IPF疾病诊断、预后评估、治疗方案选择的整体方法的一部分成为可能。现就IPF代谢组学相关研究进展予以综述。

1 与发病机制可能相关的代谢组

1.1 鞘磷脂 鞘磷脂是质膜的组成部分,并与细胞增殖途径相联系,可能与IPF的肺结构重建有关。Zhao等[13]通过对8例IPF患者与8名健康受试者肺组织的质谱检测,发现与对照组相比,IPF患者肺中的代谢物二氢鞘氨醇、鞘氨醇、鞘磷脂水平降低,微阵列数据显示IPF组SMPD1、SMPD4和DEGS1表达下调,表明神经酰胺的产生受到破坏,ACER3和SPHK1基因表达下调,表明鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)的产生受到干扰,提示IPF肺中鞘脂代谢降低。神经酰胺/鞘氨醇和S1P构成的代谢平衡参与细胞增殖与凋亡的调控[14]。S1P还与转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信 号 有关[15-16]。鞘氨醇激酶1通过细胞内S1P抑制结缔组织生长因子表达[17],而细胞外S1P通过激活Rho信号级联,交叉激活结缔组织生长因子,从而加剧纤维化过程[15]。由此可见,IPF肺组织中细胞增殖及结构重塑与鞘磷脂代谢的改变有一定关系。

1.2 精氨酸与鸟氨酸代谢 精氨酸代谢产物参与多种途径,其中肌酸参与ATP的产生,而鸟氨酸可以转化为腐胺和亚精胺,参与细胞增殖。鸟氨酸也可以转化为脯氨酸和羟脯氨酸,用于纤维化的胶原形成。Kang等[18]通过气相色谱与质谱联用技术检测13例IPF患者和15名健康受试者的肺组织,发现IPF患者肺组织中胶原的关键成分脯氨酸水平较对照组增加,这归因于通过鸟氨酸转氨酶途径产生的脯氨酸增加。相似地,Zhao等[13]的研究结果表明IPF患者肺组织中精氨酸代谢物肌酸、4-羟脯氨酸、腐胺和亚精胺水平升高。有实验显示在人IPF肺组织和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中精氨酸酶表达增加[19-20]。精氨酸酶将精氨酸转化为鸟氨酸,鸟氨酸是脯氨酸、羟脯氨酸、腐胺和亚精胺的前体,因此这些代谢物的增加可以用上调的精氨酸酶与鸟氨酸转氨酶来解释。羟脯氨酸是细胞外基质中胶原的重要组成部分[21],其升高是纤维化的标志。大量研究表明,多胺与细胞增殖、分化密切相关[22-23]。由此可见,精氨酸代谢与鸟氨酸代谢的上调在IPF发生发展中有一定作用。

1.3 核苷代谢 Kang等[18]的代谢研究表明,IPF患者肺组织中嘌呤代谢物肌苷和次黄嘌呤与正常肺组织相比增加。肌苷是腺苷的前体,细胞外腺苷水平与肺纤维化的进展与加重密切相关[24]。Luo等[24]发现支气管肺泡灌洗液中的腺苷水平随着肺纤维化的进展而逐渐升高,在进展性纤维化模型中,提高腺苷水平会导致更严重的纤维化。且腺苷水平升高与IL-6和IL-17升高相关,而IL-6和IL-17是肺纤维化中重要的炎性细胞因子。研究表明,IPF患者肺部腺苷受体增加[25]。嘌呤能信号的调节可调控组织修复和纤维化过程中的基质沉积[26]。因此,嘌呤代谢与IPF组织的瘢痕形成有密切关系。

1.4 脂肪酸β-氧化及三羧酸循环 细胞能量学对于维持肺细胞功能非常重要。主要营养底物如糖、氨基酸和脂肪酸的分解代谢将乙酰辅酶A引入三羧酸循环,产生合成核苷酸、蛋白质和脂质所需的代谢物,并产生能量。线粒体是细胞中重要的产生能量的结构,已有研究在不同的IPF肺细胞(肺泡上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞)中发现了线粒体功能障碍和代谢重编,这些促进了肺泡结构的低弹性改变,并增加了肺部细胞对促纤维化反应激活的敏感性[27]。Zhao等[13]发现IPF患者肺中长链脂肪酸己酸、辛酸、肉豆蔻酸和棕榈油酸水平显著升高,中链酰基肉碱己酰肉碱、辛酰肉碱、棕榈酰肉碱和琥珀酰肉碱明显减少。脂肪酸需肉碱转运至线粒体中发生β-氧化,游离脂肪酸积累及肉碱穿梭减少表明IPF肺组织中线粒体的脂肪酸β-氧化减少。三羧酸循环接受β-氧化和糖酵解产生的乙酰辅酶A,并为电子传输链生成还原型黄素二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,是细胞能量产生的重要途径。Zhao等[13]发现IPF肺组织中琥珀酰辅酶A合成酶及其代谢产物顺式乌头酸增加,而编码异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的基因显著减少,趋势是三羧酸循环酶和代谢物减少,潜在地表明IPF中三羧酸循环下调。三羧酸循环、线粒体β-氧化的减少可能导致替代能源途径上调,以支持细胞生长和肺结构重建。上调的肌酸代谢可能是其中之一。

1.5 糖代谢 糖酵解重编在IPF发病机制中起一定作用。Xie等[28]的实验研究表明糖酵解增强是肌成纤维细胞分化过程中的早期和持续事件,抑制糖酵解酶PFKFB3的药理或遗传方法不仅减少了体外成纤维细胞的激活,而且显著改善了小鼠肺纤维化的严重程度。而Zhao等[13]研究显示IPF肺中晚期糖酵解代谢产物1,6-二磷酸果糖和磷酸烯醇式丙酮酸水平明显低于正常,且糖酵解酶PFKFB3、PFK、PGAM1、PGAM4、G6PC3和SLC2A4RG基因表达下调,提示糖酵解率降低。但IPF组乳酸水平都高于对照组[13,28]。糖酵解高活性之后的乳酸发酵替代稳态糖酵解之后的丙酮酸氧化,是肺癌代谢的标志,被称为Warburg效应[29-30]。这种“有氧糖酵解”的确切机制尚不清楚,有人认为细胞增殖和细胞外基质的产生与这种糖酵解的变化有关[31]。IPF患者肺组织中乳酸水平升高,也提示IPF肺组织中的TGF-β激活机制可能是一种p H依赖性机制,促使IPF中肌成纤维细胞的分化[32]。

2 通过代谢组学技术寻找生物标志物的研究进展

生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价药物在目标人群中的安全性及有效性。发现疾病相关的诊断标志物是疾病诊断的关键。脂组学作为代谢组学的一个分支,能够监测患者与正常者之间的脂质变化,从中找到差异较大的脂质化合物,作为疾病早期诊断的指标。Yan等[33]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术检测IPF患者血浆中的血脂变化,鉴定其生物标志物,随后采用相关分析、受试者工作特征曲线和正交偏最小二乘判别分析评价脂代谢产物的变化,总共检测到62种独特的脂质,其中甘油磷脂24种,甘油脂30种,甾醇类3种,鞘脂4种,脂肪酸1种。所有测定的甘油磷脂和鞘磷脂在IPF对象中均呈下降趋势。其中6个(编码分别为R7、R9、R13、R16、R17和R21)对IPF组与对照组的鉴别具有较高的敏感性,可能成为未来诊断IPF疾病的潜在生物标志物,且性别和吸烟与这6个有希望的生物标志物水平没有相关性。

实时呼吸分析以非侵入性、快速和无痛的方式洞察人体新陈代谢,为IPF的诊断提供了新思路。Gaugg等[34]用二次电喷雾电离质谱分析实时呼气验证Kang等[18]在IPF患者肺组织中检测到的氨基酸信号结果,发现IPF患者呼吸中脯氨酸、4-羟脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸/异亮氨酸和大蒜氨酸水平显著升高,而焦谷氨酸和苯丙氨酸水平无显著性差异。大蒜素在胶原和弹性蛋白纤维的交联中起着关键作用[35]。弹性蛋白含有丰富的脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。焦谷氨酸和苯丙氨酸在胶原蛋白和弹性蛋白中含量较低。与其他生理参数的相关分析表明,IPF患者的氨基酸呼吸水平与通常用于IPF分期的肺功能参数(预计用力肺活量百分比和肺一氧化碳扩散能力预测百分比)基本无关,可见Gaugg等[34]通过实时呼吸分析检测到的氨基酸差异代谢物在预测IPF疾病的严重程度时有限,通过代谢组学技术寻找判断IPF分期的生物标志物有待进一步研究。

Rindlisbacher等[36]通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术分析IPF患者呼气冷凝液,发现58个代谢特征可以区分IPF患者的呼气冷凝液和健康对照者的呼气冷凝液。其中分子式为C21H44N2O的代谢物在IPF患者中与健康对照组相比上调了2.5倍,并在第二组IPF患者和健康对照组中得到验证。C21H44N2O可能是诊断IPF的潜在生物标志物,其结构仍需进一步研究。

Zhou等[37]通过UPLC-ESI-Q-TOFMS系统鉴定出IPF治疗药物尼达尼布在体内外的19个代谢产物(其中8种未被描述),ADMET预测表明尼达尼布是细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的底物,并且其大部分代谢物可能具有潜在的肝毒性和心脏毒性。此研究有助于了解尼达尼布相关不良反应的机制,关于尼达尼布对IPF的治疗反应标志物有待进一步探寻。

3 通过代谢组学技术对有效治疗靶点的探寻

Rindlisbacher等[38]通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用的方法检测到,与健康对照组相比,IPF患者血清中溶血磷脂酰胆碱和3-羟基癸酰肉碱水平升高。肺损伤后,表面活性脂质成分二棕榈酰磷脂酰胆碱被磷脂酶A2降解为溶血磷脂酰胆碱[39]。溶血磷脂酰胆碱是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)的前体,主要由自体趋化素转化。LPA是一种生物活性甘油磷脂,通过上皮细胞凋亡、血管渗漏、成纤维细胞迁移和增殖诱导肺、肾和肝纤维化[40-43]。先前的研究显示IPF患者支气管肺泡灌洗液和呼气冷凝液中LPA水平升高[43-44]。LPA还通过LPA受体2诱导αvβ6整合素介导的支气管上皮细胞TGF-β活化[45]。GLPG1690是一种口服型自体趋化素抑制剂,目前正在进行IPF的Ⅲ期临床试验,涉及750例受试者,最短治疗期为52周,若结果为阳性可能最终意味着GLPG1690单独或联合使用将成为IPF患者急需的新治疗选择[46]。

由于胶原蛋白含有高浓度的甘氨酸和脯氨酸,几个小组已经测试了抑制氨基酸生物合成是否在减少纤维化反应方面可能有效。为了支持这一方法,Hamanaka等[47]发现,从头开始的丝氨酸和甘氨酸合成途径在TGF-β诱导的胶原合成和博来霉素诱导的肺纤维化过程中是必须的,丝氨酸和甘氨酸合成途径中的磷酸甘油酸脱氢酶可能是治疗IPF的潜在靶点。磷酸甘油酸脱氢酶小分子抑制剂NCT-503可以显著减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的严重程度[47]。到目前为止,还没有确定抑制其他涉及氨基酸生物合成的酶是否同样有效。

4 结语

IPF是一种由多种原因导致的肺部纤维化疾病,预后差,病死率高。其发病机制尚未完全阐明,且治疗手段有限。代谢组学作为后基因组研究中发展最快的领域之一,可反映各种因素作用于生物体的终末效应,具有综合信息优势。通过代谢组学技术发现的IPF基本生化途径的扰动有助于更全面地了解IPF发病机制；通过代谢组学技术探寻到的IPF生物标志物有助于减少IPF诊断时患者的损伤风险；通过代谢组学启发寻找到的GLPG1690、NCT-503等药物作用靶点最终将促进患者个性化治疗的发展,提高患者生活质量。虽然代谢组学技术在代谢物的身份验证等方面仍具有相当大的挑战,但随着技术的进步,高分辨率分析仪器(如QTOF-MS)提供的代谢物覆盖范围不断扩大,利用代谢组学技术对IPF的研究将具有更广阔的前景[48]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突