李明珠， 杨柱， 吴群， 孙冬雪， 陈果， 唐东昕

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001

肺癌是全球癌症相关死亡的主要病因，其发病率和死亡率均位于我国恶性肿瘤中首位[1]。目前肺癌的治疗以手术、放化疗、靶向及免疫治疗为主，中医药辅助抗癌因其独特的优势占据越来越重要的地位，在减轻肺癌患者术后、放化疗后毒副作用，抑制肿瘤增大，改善患者生存质量方面作用尤为明显。

本研究基于刘尚义教授临证诊治肺癌用药规律探讨“葶苈子-紫菀”抗肺癌机制，刘尚义教授是第二届“国医大师”，擅长运用中医药防治肿瘤疾病，认为“痰”“瘀”“毒”是促使肺癌发生的主要病理产物，同时通过数据挖掘分析发现，刘尚义教授临床诊治肺癌常以软坚散结，活血消癥类中草药为基础，灵活配伍清热解毒类、养阴类、燥湿化痰类、止咳定喘类药物[2]。其中常用的“葶苈子-紫菀”药对便是在炙鳖甲、莪术散结消癥的基础上达到泄肺浊，宣肺气，祛痰瘀的目的。

葶苈子为十字花科植物独行菜（北葶苈子）或播娘蒿（南葶苈子）的干燥成熟种子，性寒、味苦辛，沉降下行，归肺与膀胱二经[3]，具有泻肺平端，行水消肿之功。现代药理研究表明，其主要含有黄酮类、芥子苷类、苯丙素类、有机酸类等成分[4]，具有止咳平喘、改善心血管、强心、利尿、抗肿瘤等作用[5，6]。桂家辉[7]研究表明南葶苈子的乙酸乙酯浸膏能显著诱导人非小细胞肺癌H1975细胞发生凋亡，具有成为抗肺癌药物的潜力。紫菀为菊科植物紫菀的根和根茎，味辛、甘、苦，性微温，归肺经，功能润肺下气，消痰止咳[8]。主要含有萜类、黄酮类、肽类、蒽醌类、香豆素类、甾醇类及有机酸类等成分，具有祛痰、止咳平喘、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种作用[9，10]，临床广泛用于肺系疾病。邵世祥[11]通过临床观察发现使用复方紫菀饮可提高肺癌患者化疗近期疗效，减轻化疗毒副反应，但其抗肺癌作用靶点及机制作用尚不明确。因此本文通过结合网络药理方法，对“葶苈子-紫菀”活性成分的抗肺癌作用进行研究，希望了解其中机制，为临床治疗起到指导作用。

1 资料与方法

1.1 “葶苈子-紫菀”化学成分及成分靶点的收集和筛选

通过TCMSP 数据库分别检索葶苈子、紫菀2 味药的化学成分和靶点，参考药代动力学参数（ADME），以口服生物利用度（bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件进行筛选。其中OB是指口服药物的活性基或有效成分到达体循环并被吸收的程度和速度，是评价活性成分药动学行为的关键指标；DL 是药动学特性和安全性的总和，是评价成药性优劣的关键指标[12]。

1.2 肺癌靶点筛选

分别检索GeneCards 及OMIM 数据库获取与肺癌相关靶基因，合并两个数据库所获得的数据，删除重复项后将获取药物靶点和肺癌靶点进行重合，利用Venn 2.1 软件绘制韦恩图获得“葶苈子-紫菀”活性成分具有抗肺癌作用的关键靶点。

1.3 “药物-活性成分-关键靶点”网络图的构建

依据TCMSP 平台所筛选出的葶苈子和紫菀活性成分作用靶点，以及肺癌的基因靶点，采用Cytoscape 3.7.1 软件进行网络构建并进行拓扑学分析，得到葶苈子和紫菀的主要活性成分靶标网络关系图。

1.4 靶点蛋白互相作用网络图（protein-protein interaction，PPI）构建

将“葶苈子-紫菀”与肺癌的共同靶点导入STRING数据库，限制筛选物种为“Homo Sapiens”，选取minimum required interaction score＞0.9 的蛋白相互作用网络（PPI），同时设置隐藏游离点。将所得蛋白互作关系及核心靶点导入Cytoscape 3.7.1 软件绘制网络可视图。

1.5 GO分析与KEGG通路富集分析

将网络中的靶蛋白投射到DAVID 6.8 数据库，进行GO 分析和KEGG 信号通路分析，并绘制气泡图。

2 结果

2.1 “葶苈子-紫菀”活性成分的筛选

通过检索TCMSP 数据库，根据筛选条件得到葶苈子活性成分12 种，紫菀活性成分19 种（表1），两者所含相同成分4种。

2.2 “葶苈子-紫菀”活性成分抗肺癌的潜在作用靶点预测

对27 种化学成分所对应的靶点进行筛选，去除重复靶点后得到葶苈子168个靶蛋白，紫菀178个靶蛋白。通过检索GeneCards、OMIM 数据库，合并去重后最终获得22 722 个肺癌相关靶点基因。将“葶苈子-紫菀”有效成分对应的靶点，与肺癌对应的靶点进行映射，绘制韦恩图（图1），结果表明药物与疾病交集基因共184个，其中属于葶苈子的有167个，属于紫菀的有177个，二者共同靶点160 个，即为“葶苈子-紫菀”抗肺癌潜在作用靶点。韦恩图结果提示葶苈子、紫菀均具备多个抗肺癌基因，两药关键靶点可单独发挥作用，同时又有共同的作用靶点，合用可增强抗肺癌作用。

表1 “葶苈子-紫菀”活性成分Table 1 Active constituents of“Semen lepidii-Tatarian aster”

图1 肺癌相关靶点基因与“葶苈子-紫菀”有效成分靶点关系的韦恩图Figure 1 Venn diagram of relationship between lung cancer related target and the effective component target of“Semen lepidii-Tatarian aster”

2.3 “药物-成分-靶点”网络构建分析

运用Cytoscape 3.7.1 构建“葶苈子、紫菀-活性成分-蛋白靶点”网络图并进行分析。以17种化合物和184 个潜在靶点构建相互作用网络图（图2）。图2 中三角形（黄色）代表“葶苈子-紫菀”药对，圆形（棕红色系）代表药物活性成分，菱形（蓝色系）代表蛋白靶点。并根据网络拓扑学原理筛选自由度（Degree）较大的化合物节点进行分析，网络图中Degree 越大则图中颜色越深，形状越大，其中重要的抗肺癌成分依次为槲皮素（quercetin）、山萘酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、异鼠李素（isorhamnetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、高良姜素（galangin）等。

2.4 “葶苈子-紫菀”与肺癌靶蛋白相互作用网络（PPI）的构建

从韦恩图得到药物-疾病交集靶点184 个，将这些潜在靶点基因导入STRING数据库中，经过筛选设置蛋白互作分值为0.96，隐藏网络中断开连接的节点，得到蛋白互作关系网并导入Cytoscape 3.7.1软件，进一步构建蛋白相互作用网络可视图（图3），通过线条将存在关系的两节点（即蛋白）相连，节点越大相应的度值越大，线条越多表示关联度越大，其中包含184 个节点，322 条边，平均节点数3.5，平均类聚数0.342。其中度值排名前5的蛋白质为TP53、JUN、TNF、AKT1、CDKN1A，这些度值较大的蛋白质在整个网络中起着关键的作用。

图2 “葶苈子-紫菀”有效成分和肺癌的靶点网络Figure 2 Target network of active components of“Semen lepidii-Tatarian aster”and lung cancer

图3 “葶苈子-紫菀”和肺癌共同靶点蛋白相互作用关系图Figure 3 Protein-Protein Interaction between of common targets of“Semen lepidii-Tatarian aster”and lung cancer

2.5 GO分析及KEGG通路分析

将“葶苈子-紫菀”与肺癌交集的184 个共同靶点导入DAVID 6.8 数据库，物种选择Homo sapiens（Human），得到GO 分析632 个生物过程，KEGG相关信号通路132条。

图4 “葶苈子-紫菀”抗肺癌的生物学过程分析图Figure 4 Analysis of the anti-lung cancer biological process of“Semen lepidii-Tatarian aster”

2.5.1 基因生物功能（GO）分析

图5 “葶苈子-紫菀”抗肺癌的信号通路图Figure 5 Anti-lung cancer signal pathway of“Semen lepidii-Tatarian aster”

表2 “葶苈子-紫菀”药对抗肺癌的基因生物功能信息Table 2 Gene biological function information of“Semen lepidii-Tatarian aster”in treatment of lung cancer

在632条生物学功能分析条目中，根据校正后P值排序筛选功能排名前20名条目（P ≤0.01），利用AIPuFu 平台绘制“葶苈子-紫菀”抗肺癌的生物学过程分析图（图4），图中横坐标代表靶点在该生物学过程所占得比例，纵坐标则为生物过程名称，点越大表示富集基因越多，点色越深表示P值越小，关系越密切。根据GO分析图结果显示富集的生物学功能主要涉及药物反应、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、DNA 模板转录的正调控、细胞缺氧反应、基因表达的正调节、凋亡过程的负调控、雌二醇反应、脂多糖反应、炎症反应等（表2），表明“葶苈子-紫菀”参与以上生物学调控过程发挥抗肺癌的效果。

2.5.2 KEGG通路富集分析

从David数据库获取KEGG相关信号通路132条，根据校正后P 值排序筛选功能排名前20 名条目（P ≤0.01），利用AIPuFu 平台绘制“葶苈子-紫菀”抗肺癌的信号通路图（图5），图中横坐标代表靶点在该通路中所占比例，纵坐标为富集所得通路名称。根据通路图可知，“葶苈子-紫菀”化学成分靶点主要富集的通路涉及癌症通路、非小细胞肺癌通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，以及乙型肝炎、恰加斯病（美洲锥虫病）和前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等其他肿瘤相关信号通路（表3）。表明“葶苈子-紫菀”药对的有效成分靶点可以通过不同通路作用于肺癌，同时拓展治疗其他疾病和癌症的路径。

表3 “葶苈子-紫菀”药对抗肺癌的关键通路Table 3 Key pathway of“Semen lepidii-Tatarian aster”in treatment of lung cancer

3 讨论

葶苈子、紫菀均可润肺下气，化痰止咳，《中华本草》将葶苈子归为肺、膀胱、大肠经[13]，同时紫菀具有通利二便，祛瘀通腑之功。《本草汇言》：“治老人血枯气燥，大便不通。”《素问·太阴阳明论》云：“脾与胃，以膜相连耳”，“肺与大肠相表里”是中医重要的脏腑理论，肺与大肠通过经脉的络属而构成表里关系，两者在生理上相互协调，病理上相互影响，治疗上相互为用。粪便移植和益生菌的补充已被证明能对多种肺部疾病起到积极的疗效，肠道菌群也被证明可以提高宿主抗癌免疫反应[14]。中医学从表里经及药物功能入手，通过使用归经于大肠的药物，对肺癌起到了积极的疗效[15]。临床以葶苈子、紫菀为主药的常用方有葶苈大枣泻肺汤、葶苈子十五味丸、紫菀饮等，对咳嗽、痰饮病有较好疗效。

通过筛选，葶苈子和紫菀发挥药效的核心化合物主要为槲皮素、山萘酚、木犀草素、异鼠李素、β-谷甾醇、常春藤皂苷元、高良姜素。槲皮素、山奈酚、异鼠李素及木犀草素均属于黄酮类物质，广泛存在于中草药及果蔬中，并被广泛应用于癌症的治疗中[16]。研究表明槲皮素可通过抑制STAT3 信号通路，进而抑制肺癌A549 细胞的迁移和侵袭能力[17]。山奈酚可通过抑制ERRα发挥降低非小细胞肺癌A549 细胞侵袭和迁移能力[18]。朱玲等[19]进行体内外研究结果表明异鼠李素可下调bcl-2基因、PCNA蛋白表达；上调抑癌基因P53，bax及caspase-3 基因，抑制人体肺腺癌A549 细胞生长。木犀草素是主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草等传统中药中，有研究证实木在H460移植瘤模型中，木犀草素可通过上调miR-34a-5p，达到抑制肿瘤生长，并诱导凋亡的目的[20]。β-谷甾醇是植物甾醇类化合物之一，广泛存在于蒲葵、爪钩草等植物药物中。β-谷甾醇能明显抑制肺癌A549、NCI-H460细胞的生长，且呈现剂量依赖性，同时可将A549 细胞周期进展停滞于G2/M期，并引起细胞凋亡性死亡[21]。常春藤皂苷元为齐墙果酸的衍生物，是一种广泛存在于药用植物中的单体化合物。常春藤皂苷元可抑制裸鼠肺癌A549 肿瘤的生长，且受其纯度的影响，进一步证实常春藤皂苷元是具有抗肺癌作用的活性成分[22]。高良姜素是中药高良姜的主要活性成分之一，研究证实高良姜素可能通过抑制PI3K/AKT 活性，抑制肿瘤细胞体外增殖及侵袭能力[23]。结果显示两药包含相同及不同的化合物，这些化合物均有各自不同的药理功效，整体配伍使用后可提高其抗肺癌作用。

根据蛋白互作关系网络分析，本研究中获得的主要靶点为TP53、JUN、TNF、AKT1、CDKN1A。在这些关键靶点中，TP53 为重要抑癌基因，参与细胞凋亡或细胞周期调控过程，其突变常在肺癌及肺癌高风险个体中发现，86%的小细胞肺癌中发现TP53 基因突变[24]，甚至因此被视为肺癌疗效或预后的预测标志物。突变型TP53 基因不仅丧失抑癌功能，同时获得促进细胞增殖、迁移及抑制细胞凋亡等功能[25]。JUN 蛋白是转录因子AP-1 家族成员，c-Jun蛋白基因可通过参与活化AP-1，进而参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等[26]。当原癌基因c-Jun被激活、过度表达及蛋白磷酸化后，能促进支气管上皮细胞癌发生[27]。肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族指一组可以引起细胞死亡或凋亡的细胞因子，活化的巨噬细胞是TNF-α 的主要来源，机体巨噬细胞在肺癌微环境中可与TNF-α 相互激发，TNF-α 高表达进一步促进肺癌微血管形成，成为肺癌发生发展的可能机制之一[28]。AKT1 可调节细胞功能，通过参与细胞凋亡过程影响细胞的生存[29]。CDKN1A是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可在G1期调节细胞周期进展，近年来研究表明CDKN1A在肺癌细胞凋亡过程中发挥重要作用[30]。

本文中KEGG 富集通路表明“葶苈子-紫菀”主要通过癌症通路、非小细胞肺癌通路，TNF、Toll样受体等炎症相关通路，PI3K/Akt等疾病代谢信号通路，HIF-1信号通路及其他癌症通路发挥抗肺癌的作用。PI3K/Akt是经典信号通路之一，涉及细胞增殖、凋亡、自噬、免疫调节等方面[31]，与内皮祖细胞（EPCs）分化密切相关，通过抑制PI3K/AKT 通路的活性可降低EPCs在肿瘤微环境中血管新生能力，进而抑制肺癌生长[32]。研究证实PI3K/Akt 信号通路对p53 的表达具有关键调控作用[33]。TNF 信号通路与细胞凋亡关系密切，TNF-α 通过激活TNF 信号通路可促进肺癌细胞侵袭和转移[34]。研究发现通过使脂多糖与Toll样受体4（TLR4）结合而激活TLR4 信号转导途径，进而分别活化c-Jun和c-Fos 的异源二聚体，使肺癌细胞持续增殖[35]。研究证实在肺腺癌中，miR-30a 低表达可诱导HIF-1α激活，促进肺腺癌细胞的生长[36]。

综上所述，本研究初步探讨“葶苈子-紫菀”药对的活性成分、核心靶点、关键抗癌机制及通路，可知“葶苈子-紫菀”能从不同途径防治肺癌，对肺癌的干预主要体现在影响肺癌的形成，抗细胞侵袭、转移、增殖及凋亡等多方面。中药材既是中医治病的药物资源，也是化学药品、国际植物药、食品工业等的重要原料。通过系统药理学研究“葶苈子-紫菀”抗肺癌的活性成分、关键靶点和信号通路，将为后续实验验证提供新思路，并有利于充分挖掘药物的应用价值。