王 珏，胡丽丽，张育敏，吴 娜，李 睿

(山西中医药大学 基础医学院，晋中 030600)

天然蛋白由于性能的局限性，在一些反应中有所限制，故须对目的蛋白进行改造，以优化相关活性或稳定性。传统的方法包括理性设计点突变及定向进化技术引入随机突变[1-2]。这两种技术也并不独立，很多学者通过结合目标蛋白三级结构，对定向进化得到的随机突变位点进行分析，可筛选出对于目的基因改造更有意义的突变位点，从而打破进化瓶颈，实现改造蛋白多种性能的目标[3]。

RML是源于真菌米黑霉的脂肪酶，其全基因序列包括24个氨基酸构成的信号肽，70个氨基酸组成的前导肽以及269个氨基酸组成的成熟区3部分，其中前导肽位于成熟区的N端，主要作用是帮助目标蛋白正确折叠[4]。成熟的RML可催化甘油三酯为甘油二酯，为工业油脂的改良所应用。但由于其来源于嗜温微生物，在高压高温等环境中不稳定、易失活，不利于大规模工业生产[5]，因此，对RML热稳定性的改造显得尤为重要。近年来人们也开始通过氨基酸序列突变结合蛋白结构模拟来预测突变对于蛋白热稳定性的影响[6]，有关RML热稳定性研究的最新报道是通过计算机模拟对RML成熟区(不包括前导肽)进行定点突变及二硫键的设计，得到的突变体半衰期比野生型提高了12.5倍(70 ℃处理下)[7]。前期工作证明，前导肽突变对RML活性有影响[8]，因此，包含前导肽的全基因进化为蛋白性能的改造拓展了基因研究范围。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 RML全基因序列与pET30a构建的重组质粒，命名为pET30a-pro-RML，用作第一轮定向进化中易错PCR的模板；……