张婧 翟琳 万炳军 周园 李小龙

摘 要：目的：应用蛋白质组学技术辨析在血清样本中与运动性疲劳有关差异表达蛋白。方法：以17～21岁的10名成年男性为研究对象，建立运动疲劳模型。应用蛋白质组学技术，对运动疲劳前后血清中的蛋白质样品在相同条件下进行3次双向电泳，利用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行图像的强度校正、点检测、匹配等分析。根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值大于2.0，且同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，被认为是差异蛋白质点。结果：研究发现，运动疲劳前后共检测出34个差异蛋白质点。最终鉴定出运动疲劳后表达上调的蛋白和表达下调的蛋白分别为6种，涉及到急性相蛋白、免疫相关蛋白、脂代谢相关蛋白和神经调节相关蛋白。结论：通过蛋白质组学技术高通量筛选后，发现与运动性疲劳有关差异表达蛋白有12种，其中，表达下调的α1-B-糖蛋白、丛生蛋白和结合珠蛋白，表达上调的α2-HS-糖蛋白、载脂蛋白E有必要进一步研究，确定其是否可以作为判断运动性疲劳的新的分子靶标。

关键词：运动性疲劳;蛋白质组;血清蛋白

中图分类号：G804.7  文献标识码：A  文章编号：1009-9840（2021）06-0050-07

Screening of serum differential proteins associated with exercise-induced fatigue

ZHANG Jing， ZHAI Lin， WAN Bingjun， ZHOU Yuan， LI Xiaolong

（School of Physical Education， Shaanxi Normal University， Xi'an 710119， Shaanxi， China）

Abstract：Objective：The different protein expression related to exercise-induced fatigue in serum samples was discussed by using proteomics techniques. Method：In this study， 10 male students aged 17 to 21 years were the research object building the model of sports. Protein samples in serum before and after exercise fatigue were screened applying the proteomics technology. The differential protein points were enzymolyzed being analyzed by the MALDI-TOF mass spectrometry and identified through searching the SwissProt Database. Result： A total of 34 different protein spots were detected before and after exercise fatigue. Finally， 12 proteins were identified as up-regulated and down-regulated after exercise fatigue， which involves acute phase proteins， immune-related proteins， lipid metabolism-related proteins and neuroregulatory proteins. Conclusion：After high throughput screening by proteomics technique， 12 differentially expressed proteins related to exercise-induced fatigue were found， among which， the down-regulated α1-B-glycoprotein， fascicular protein and binding globin， and the up-regulated α2-hs-glycoprotein and apolipoprotein E should be further studied to determine whether they can be used as a new molecular target for the determination of exercise-induced fatigue.

Key words： exercise-induced fatigue; proteomics; serum protein

收稿日期：2021-05-08

基金项目：陕西省科技厅区域创新引导计划项目“运动+膳食”健康管理智能云平台的研制与应用（编号：2020QFY01-03）。

作者简介：张婧（1975- ），女，博士，副教授，主要研究方向科学运动与慢性病防控。

一直以来，关于运动性疲劳的产生机理和消除方法一直备受各国专家学者关注[1-3]，但由于疲劳现象十分复杂，运动性疲劳涉及众多的代谢过程和调节机制，代谢物种类繁多，运动的类型、强度和时间均会对其产生一定影响。因此，判断疲劳的生物指标缺乏特异性是制约运动性疲劳机制研究的瓶颈之一。目前研究也发现，在运动疲劳发生、发展和一些间接的诊断指标都和蛋白质代谢有關[4]。蛋白质组学是对细胞或生物体全部蛋白质的系统鉴定、定量并阐释其生物学功能的学科[5]。近年来，蛋白质组学已广泛地被应用于生物学和临床医学研究[6-8]。蛋白质作为机体内生理功能的直接执行者，推测一定能从其中筛选出与运动疲劳相关的生物标志物。本研究应用蛋白质组学技术，通过对正常状态及运动疲劳状态下个体间的血浆蛋白质组比较分析，筛选出与运动性疲劳发生、发展中相关的异常蛋白质，寻找潜在的与运动性疲劳密切相关的血浆特异性生物标志物，可为运动性疲劳的早期诊断和科学健身的评价提供可靠的实验依据，并为抗运动性疲劳药物的开发提供新的分子靶标。

1 研究方法

1.1 研究对象

以年龄为17～21岁的10名成年男性为研究对象，基本特征如表1示。

1.2 疲劳模型建立

各研究对象以最大心率80%进行平板跑台运动，通过《主观体力感觉等级量表》进行运动疲劳状态的评定[9-11]，至主观体力感觉等级到12～14（即有点困难，见表2）视为疲劳。同时测定其最大吸氧量、呼吸频率，并在运动前、运动后3分钟分别测定受试者的心率、血压，同时分别取血3 mL以制备血清，测定血糖（BG）、血红蛋白（Hb）和乳酸脱氢酶（LDH）等生化指标对疲劳程度进行界定。

1.3 样品的采集

运动前、后收集静脉血于采血管中，待血液自然凝固后，用牙签沿管壁轻轻剥离血凝块，避免溶血。4℃下冷冻离心（3 000/rpm）10 min，吸取上清液（血清）于-80℃保存备用。

1.4 血红蛋白、血糖和乳酸脱氢酶的测定

1.4.1 血红蛋白和乳酸脱氢酶的测定

采用化学比色法测定血浆游离血红蛋白的含量和血清乳酸脱氢酶活性，按照试剂盒（购置于南京建成生物工程研究所）说明书操作步骤进行测定。

1.4.2 血糖测定

采用葡萄糖氧化酶法利用耐利eB-G型血糖仪进行测定。

1.5 蛋白质双向电泳

本研究中人血清蛋白的双向电泳分析、凝胶图像分析和质谱检测与分析均在广州辉骏生物科技有限公司按试剂盒操作说明书或常規实验操作方法完成。简单描述包括以下步骤：1）一向等点聚焦：此过程中包括蛋白质溶解、定量、上样、泡胀、等电聚焦等步骤。2）二向SDS-PAGE：SDS-PAGE凝胶配方如表3。这一步包括装灌胶器、配液灌胶、准备玻璃板、配置上槽液、胶条平衡、配置上槽液、垂直电泳和染色等步骤。

1.6 质谱鉴定

首先要进行质谱前处理，包括挖点、酶切、肽段抽提和点靶。然后利用德国布鲁克MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱鉴定。利用软件flexAnalysis（Bruker Dalton）对质谱峰进行处理后，再利用BioTools（Bruker Dalton）软件通过搜索NCBI数据库，查询匹配的相关蛋白质，并查询其功能，以鉴定的蛋白质名称或种类。

2 结果与分析

2.1 运动疲劳前后血红蛋白、血糖和乳酸脱氢酶的变化

本研究结果显示（如图1所示），运动疲劳后血红蛋白（Hb）、血糖（BG）和乳酸脱氢酶（LDH）分别下降了约24%、31%和16%。

长时间大运动负荷训练可导致机体Hb降低，形成运动性Hb低下状态[12-13]，进而引起红细胞运输氧和二氧化碳能力及物质代谢能力的下降，进而影响运动能力，可能导致疲劳的发生。本研究结果显示运动后Hb下降了约24%。如果按照运动前正常Hb的最低浓度120 g/L计算，运动后Hb的浓度就为91.2 g/L，按照男性贫血的临床判断标准（<120g/L）， 这已经接近中度贫血（<90g/L），提示疲劳模型建立成功。

机体在进行长时间较大强度运动时，为了维持运动肌肉不间断的能量需求，BG经血液循环被输送到骨骼肌中以满足机体运动的能量需求。一般情况下，机体BG水平处在一个相对稳定的水平。但是，当机体激烈运动时，肌糖原、BG大量消耗，而肝糖原分解和糖异生作用又不能保证BG的及时补充时，BG水平就会降低。同时，由于BG还是中枢神经系统、红细胞等组织必需的能源物质，所以一旦BG降低，可能会出现头晕、恶心等症状。文镜[14]等研究发现，小鼠游泳70 min时，血糖水平、血糖下降值和血糖下降速率能够较好地反映小鼠在长时间运动中体内糖储备的变化情况，测定安静值的负重（体重3%）游泳70 min时血糖值，能够作为评价影响糖代谢抗疲劳保健食品的一项指标。本研究结果显示（如图1所示），运动后BG下降了约31%，如果按照运动前正常BG的最高浓度6.1 mmol/L计算，运动后BG的浓度就为4.2 mmol/L，接近正常BG的最低浓度3.9mmol/L，说明本研究运动疲劳模型建立时，血糖浓度大幅度降低，疲劳可能已经出现。

LDH是糖酵解过程中催化丙酮酸和乳酸转化的一种酶。大强度运动后血清中LDH的活性会升高，其机制一方面是因为大强度运动过程中，糖酵解功能系统占主导地位，另一方面可能是因为运动时由于机械牵拉或损伤使得细胞膜通透性增加。但是本研究结果显示（如图1所示），运动后血清LDH下降了约16%，其原因可能是，本研究在模型建立时采取的运动方案属于中等强度的运动，其主要以有氧代谢供能为主，而在有氧代谢过程中丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶系的作用下进入三羧酸循，所以乳酸脱氢酶活性会下降。

2.2 双向电泳和质谱分析结果

2.2.1 运动疲劳前血清蛋白质组的双向电泳分离

对蛋白质样品在相同条件下进行3次双向电泳，利用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行图像的强度校正、点检测、匹配等分析。根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值大于2.0，且同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，被认为是差异蛋白质点。比较结果发现，运动疲劳前后共检测出34个差异蛋白质点。具体双向电泳图谱及差异蛋白点的位置如图2所示，A1～A56为运动疲劳后表达下降的蛋白质点;如图3所示，B1～B33为运动疲劳后表达升高的蛋白质点。

2.2.2 运动疲劳前后差异蛋白点的质谱鉴定结果

最终从电泳图谱中选取16个差异蛋白点进行胶内酶解，MALDI-TOF/TOF质谱分析显示，大多数肽质量指纹图谱背景低，峰信号较强。通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白，去除鉴定结果相同的蛋白点，共鉴定出12种蛋白质，蛋白质评分均大于56（P<0.05），说明鉴定结果高度可信。具体蛋白质质谱鉴定和搜库结果见表4。

2.3 运动疲劳前后血清蛋白质组差异性变化

通过双向电泳（two dimentional electrophoresis， 2DE）联合质谱分析技术，对运动疲劳前后血清蛋白质组进行差异性研究，得到了分辨率较高、重复性较好的电泳图谱，经过分析比较及质谱鉴定，最终鉴定出16个差异蛋白点，去除结果相同的蛋白，共包含12种蛋白，其中运动疲劳后表达上调的蛋白和表达下调的蛋白各为6种（如表4所示）。

2.3.1 运动疲劳后血清中表达下调的蛋白质

表达下调的蛋白有α1-B-糖蛋白、丛生蛋白、免疫球蛋白α1链C结构域、血管紧张素原、补体C4-A和结合珠蛋白。

董凌月[15]等研究认为人α-1B糖蛋白是免疫球蛋白超家族的一个新成员，可能和金属蛋白酶抑制因子一样具有蛋白酶抑制剂作用，推断α-1B糖蛋白可能在细胞识别和细胞行为的调节方面起作用[16]。Doherty et al[17]研究发现，患有类风湿性关节炎的人血浆α-1B糖蛋白水平降低，但其具体的生物学功能还不清楚。丛生蛋白（CLU， clusterin）与许多生理和病理过程有关[18]，包括补体抑制[19]、炎症调节[20]、脂质转运[21]、细胞凋亡[22]、细胞分化[23]、食欲调节[24]和蛋白质量控制[25]等。最新研究发现，在模拟神经退行性疾病的特异性特征的条件下，增加丛生蛋白的表达可以为细胞内的蛋白质毒性提供重要的防御作用[26]。

免疫球蛋白α1链（IGHG1）属于免疫球蛋白重链之一。運动后有关Ig的变化报道不一致，有的是增加[27-28]，有的是降低[29]，也有的是不变[30-31]。血管紧张素原（Angiotensinogen）是一种血清球蛋白，是合成血管紧张素的前体，也是肾素-血管紧张素系统 （ renin- angiotensin system，RAS）的一种限速底物。RAS的主要功能是调节人体血压、水分、电解质和保持人体内环境的稳定性。Groban等研究发现，中枢RAS 对中年人舒张功能和运动耐受性的维持起着重要作用[32]。补体C4（Complement C4）是一种多功能β1-球蛋白，存在于血浆中。Ernst等研究发现，运动后补体C4略有上升，无统计学意义[33]。已有报道，C4通过树突细胞参与T细胞分化为调节性T细胞（ regulatory T cells，Tregs） [34]。Tregs是一类控制宿主自身免疫反应且具有抑制作用的 T 细胞亚群，在自身免疫稳态的维持及移植物免疫耐受中发挥重要作用，同时也对宿主抗肿瘤免疫起到一定程度的抑制作用[35]。触珠蛋白（Haptoglobin， Hp）是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及维持内环境稳定等方面起着重要作用[36]。Hp的主要功能是通过捕捉血红蛋白保护组织免受抗氧化损伤[37-39]。最新研究表明，在肾移植患者中，Hp和代谢综合症有关，独立于炎性反应，并且高、低水平的Hp都会增加死亡率的风险，尤其心血管;其中高水平的Hp可以作为肾移植患者炎性反应的标志物，低水平的Hp是死亡率的独立风险因素[40]。运动疲劳后，Hp表达下调，是否和运动疲劳后血红蛋白下降和心血管机能有关，还需进一步实验研究。

2.3.2 运动疲劳后血清中表达上调的蛋白质

表达上调的蛋白有α2-HS-糖蛋白、抗凝血酶-Ⅲ、血清白蛋白、CD5抗原、结合珠蛋白相关蛋白、载脂蛋白E。

α2-HS-糖蛋白（Alpha-2-HS-glycoprotein， A2HSG）在机体内主要参与血管钙化、骨代谢调节、胰岛素抵抗、蛋白酶活性调控、角质形成细胞迁移及乳腺肿瘤细胞增殖的信号转导等生理病理过程[41-45]，同时也被确定为神经退行性疾病的生物标志物[46]。Kanno 等[47]研究表明A2HSG和血液结合素是调节小分子化合物进行神经保护作用的内源性因子。在本研究中，运动疲劳后血浆蛋白组学结果表明，A2HSG表达上升，这可能主要与胰岛素抵抗、蛋白酶活性调控有关;另外，也可能是机体在疲劳状态下对神经的保护性作用。抗凝血酶Ⅲ（AT Ⅲ）通过抑制凝血酶发挥其功能，并参与凝血调控[48]。AT Ⅲ的血清浓度与体脂质量和HbA1c有关，与年龄、性别无关。然而，实施两种干预策略后，发现健康肥胖者体内脂肪量的变化与AT Ⅲ的变化无关，这表明体脂质量不会直接导致AT Ⅲ循环加快[49]。运动疲劳后AT Ⅲ表达上调，可能与运动引起血液循环加速有关。血清白蛋白（ALB）是人血浆中的蛋白质，约占血浆总蛋白的60%。具有结合和运输内源性与外源性物质的性质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。在体液中可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等。其表达上调，可能是由于运动疲劳引起Hb下降，其代谢产物胆红素升高以及自由基等产生增多引起的机体代偿性的反应。CD5L也被认为是巨噬细胞凋亡抑制剂，是富“含半胱氨酸结构域的清道夫受体”超家族蛋白之一，最初被认为是一种保护吞噬细胞的循环蛋白[50-52]（circulating protein）。已经证实其可以通过管状内皮细胞加强急性肾损伤时管腔内碎片的清除[53]，也可以通过引起细菌或真菌的聚集来发挥抗菌作用[54-56]。目前的研究已经确定CD5L是预测Ⅱ型糖尿病肾功能快速下降的新型的血浆生物标志物之一，并且独立于临床已经公认的糖尿病危险因子[57]，也是未确诊的银屑病关节炎血浆生物标志物之一[58]。另外，运动刺激会引起交感神经系统活动增加，儿茶酚胺水平提高，儿茶酚胺（catecholamines）能诱导脂肪分解。Camell等[59]研究发现，巨噬细胞能分解儿茶酚胺，这样会导致儿茶酚胺无法发挥诱导脂肪分解的效应。在运动过程中细胞代谢加快，同时机体代谢产生的细胞“垃圾”增多可以诱导巨噬细胞增多。由此可见，本研究中运动疲劳后血清CD5L水平升高可以抑制巨噬细胞凋亡，加强了儿茶酚胺分解，致使脂肪分解效应降低，能量代谢不足，这可能是疲劳发生的机制之一。

结合珠蛋白相关蛋白（Haptoglobin-related protein，Hpr）是高密度脂蛋白（HDL）小亚种的组成成分，与先天性免疫性有关[60]，是灵长类特有的通过Hp基因复制蛋白逐渐进化而来[61]，其氨基酸序列与Hp的同源性大于90%[62]，不同的是Hpr中保留了一个N-末端分泌信号序列[63]。HDL水平的改变将导致Hpr水平的变化[64]。Hpr和载脂蛋白L1（ApoL1）构成了基因编码）构成了溶锥虫因子TLF-1。ApoL1是近年来发现的新型载脂蛋白，具有抗非洲锥虫病的人血清蛋白，其某些突变体可增加渐进性肾脏疾病的易感性[65];它可以选择性渗透氯离子到未成形的磷脂囊泡中，并且这种选择渗透性具有很强的pH敏感性，pH=5时选择渗透性最强，pH=7时选择渗透性最小;在pH降低时ApoL1和脂质相互作用使pH值呈中性，氯离子的渗透性被抑制，而钾离子的渗透性被激活;这种可转换的离子选择渗透性可能解释了已经报道的ApoL1在细胞内和等离子膜环境中的不同作用[66]。Hpr定位的HDL亚种独特地含有载脂蛋白L-1[67]，所以本研究中Hpr表达上升可能与运动疲劳后血液pH值下降有关。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一种多态性蛋白，在脂质和胆固醇代谢中起着重要作用。推测本研究中载脂蛋白E的上调可能与运动引起脂肪供能比例增加、脂肪动员加速、血浆甘油三酯含量上升有关。ApoE也是大脑中最丰富的载脂蛋白之一，主要是由星形胶质细胞合成，已经有证据表明它具有神经营养、免疫调节和抗氧化效应[68]，参与许多神经系统疾病的生理病理过程[69-70]，运动疲劳后ApoE表达上升可能是机体代偿性保护机制之一。

3 结论

通过蛋白质组学技术高通量筛选研究发现，与运动性疲劳相关差异表达蛋白涉及到急性相蛋白、免疫相关蛋白、脂代谢相关蛋白和神经调节相关蛋白。如果后期研究利用其他生物学方法如ELISA、Western-blotting等进行蛋白功能和扩大样本例数进行验证，有望从这些蛋白中筛选出与运动性疲劳密切相关的血浆特异性标志物，为运动性疲劳的早期诊断和科学健身的评价提供可靠的实验依据，并为抗运动性疲劳药物的开发提供新的分子靶标。

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