浦飞飞 陈凤霞 邵增务 刘建湘 张志才

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，免疫治疗是继手术和放化疗之后的有效治疗手段[1]。免疫调节学说较为全面地阐述了骨肉瘤的发病机制，免疫调节学说与中医正邪相争学说存在高度统一，中医学认为骨肉瘤的发生是正(宿主)与邪(肿瘤)相互斗争的过程，微环境紊乱将导致阴阳失衡。中医将骨肉瘤归属“骨瘤”范畴，病机为“正虚邪实，邪盛正衰”，应“扶正祛邪，攻补兼施”[2]。既往研究表明中医药可提高骨肉瘤的放化疗时机体免疫功能，增加放疗敏感性，逆转化疗多药耐药，抑制肿瘤远处转移[3]。中医认为热毒蕴结是肿瘤的重要发病因素，《内经·素问》提出“热者寒之”的观点，白花蛇舌草等清热解毒药在中药防治肿瘤中起重要作用[3-4]。笔者在既往的研究中发现白花蛇舌草水提取物联合顺铂对骨肉瘤细胞有协同抗肿瘤作用，可抑制细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡[5]。但是白花蛇舌草抗肿瘤成分和机制尚不明确，文献表明黄酮类成分能抑制肿瘤并增强免疫功能[4]。笔者通过分离提取白花蛇舌草总黄酮(Total Flavones of Oldenlandia Diffusa，FOD)，进一步研究FOD的抗肿瘤作用及免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞株

选用40只SPF级4～6周龄18～20 g的BALB/c小鼠，雌雄各半。构建骨肉瘤胫骨原位移植瘤小鼠模型，随机分为空白对照组和FOD组，每组各20只。SPF级别4～6周龄BALB/c小鼠40只，性别雌雄各半，体质量18～20 g，中位数19 g，华中科技大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2016-0009，实验动物使用许可证号SYXK(鄂)2016-0057。人成骨肉瘤MG63细胞株(美国ATCC公司，批号为CRL-1427)。本研究动物实验经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准(伦审字S2019009号)，符合华中科技大学动物研究规范。

1.2 实验药物及试剂

1.3 实验仪器

流式细胞仪(德国西门子公司，型号为Partec Pas)，多功能全自动酶标洗板机(北京普天新桥技术有限公司，型号为PTW-1000)，离心机(上海楚柏实验室设备有限公司，型号为CN-2060)。

1.4 方法

1.4.1实验细胞培养 MG63骨肉瘤细胞培养在DMEM培养液(10%小牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，细胞培养在37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下的CO2培养箱，每隔2 d换液并传代1次。

1.4.2造模方法 收集处于对数生长期的MG63细胞，对细胞进行计数，当活细胞超过90%时可进行造模。根据参考文献所述组织块移植法构建小鼠胫骨原位骨肉瘤模型[6]。

1.4.3分组方法 造模成功后，将40只小鼠随机分为空白对照组和FOD组，每组各20只。

1.4.4干预方法 根据文献报道选用对实体瘤有明显抑制作用的FOD药物浓度(5 mg/kg)，对FOD组小鼠按照0.1mL/l0g药物浓度进行肌内注射给药，对照组小鼠予以生理盐水肌内注射给药，1次/d，连续给药15 d[7]。

1.4.5标本制作方法 小鼠末次给药12 h后，采用颈椎脱臼法处死小鼠并称重，先行眼球采血，再解剖获取胸腺和脾脏。小鼠眼球采血后静置2 h，按照4 000 r/min离心收集血清和细胞沉淀，分别检测淋巴细胞亚群和免疫相关因子。用滤纸吸取器官和组织表面残血及多余的水分，称取湿重并分别计算胸腺指数和脾脏指数。

1.5 实验指标测定

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 胸腺指数和脾脏指数检测

FOD实验组与空白对照组相比，FOD组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组小鼠胸腺指数和脾脏指数

2.2 淋巴细胞亚群检测

表2 两组小鼠淋巴细胞亚群比例

2.3 免疫相关因子检测

FOD实验组与空白对照组相比，FOD组小鼠IL-2、TNF-α和IFN-γ显著升高，IL-4和IL-6显著降低，各组数据差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组小鼠免疫相关因子含量

3 讨论

中医文献将骨肉瘤归属“骨疽”和“骨瘤”范畴，中医学认为骨肉瘤的病机为“正虚邪实，邪盛正衰”，基本治则应“扶正祛邪，攻补兼施”[2，8]。中医学认为骨肉瘤的发生发展是正(宿主)与邪(肿瘤)相互斗争的过程，微环境紊乱将导致阴阳失衡[2]。机体激活细胞免疫、体液免疫等免疫效应，导致局部微环境免疫聚集，控制肿瘤细胞扩散，中医理论认为这是机体正气抵御邪气。但机体免疫系统全力抵抗肿瘤时出现短暂紊乱现象使部分免疫细胞分化变异，导致淋巴细胞分化障碍，出现免疫无能、免疫耐受、免疫抑制等，类似中医理论的正邪相争后正气消耗而无力抗邪。T细胞免疫反应在维持机体稳态中起重要作用，T细胞亚群失衡将导致免疫功能紊乱，过多表达的细胞因子促使肿瘤微环境紊乱，进而出现T细胞亚群漂移现象，导致免疫失衡，这体现了中医正邪相争导致阴阳失衡和邪盛正衰的观点[9-10]。

中医对肿瘤病因的认识主要涉及热、毒、瘀、虚，治疗多采用清热解毒、活血化瘀和扶正固本的方法，因而清热解毒、活血化瘀和扶正固本药是最受关注的抗肿瘤中药[11-12]。中医理论认为热毒蕴结是肿瘤的重要发病因素，《素问·至真要大论》提出“热者寒之”，因此，白花蛇舌草等清热解毒药在中药防治肿瘤中起重要作用[13]。药理研究表明，白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等作用，其抗肿瘤作用受到广泛关注，实验证实白花蛇舌草可抑制肿瘤增殖、侵袭和转移，诱导凋亡，调节免疫[4]。白花蛇舌草清热解毒的功效可祛除热毒，避免留滞体内耗气伤津，使正气渐复，阴阳自和，此即“邪去正自安”，与现代药理学体现的抗肿瘤并增强免疫功能具有统一性。

笔者在前期研究中发现白花蛇舌草水提取物联合顺铂对骨肉瘤细胞有协同抗肿瘤作用，可抑制细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡[5]。然而，白花蛇舌草的抗肿瘤活性成分和作用机制尚不明确。药理学研究发现白花蛇舌草活性成分主要有黄酮类、多糖类、蒽醌类、萜类和有机酸类等，其中黄酮类成分能抑制肿瘤生长并增强机体免疫功能。王秋兰等[13]通过研究FOD对胃癌细胞BGC-823株CLIC4蛋白表达的影响，探讨FOD对肿瘤间质形成和肿瘤浸润转移的影响。结果发现CLIC4与胃癌间质形成相关，促进肿瘤的进展；FOD可抑制CLIC4的表达，减少恶性肿瘤间质的形成，抑制肿瘤浸润和转移。张彦兵等[14]研究了FOD对肝癌MHCC97-H细胞增殖和凋亡的影响，结果表明FOD能显著抑制肝癌细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，呈时间依赖性和剂量依赖性。

本研究结果说明FOD能够调节骨肉瘤胫骨原位移植瘤小鼠模型免疫相关因子表达，为骨肉瘤的综合治疗提供新的治疗手段。