徐丹 曹鹏 周玉珍 许豪勤 王大为

遗传代谢病是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和/或蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽（蛋白）的基因发生突变而导致的疾病，又称遗传代谢异常或先天代谢缺陷。遗传代谢病就是有代谢功能缺陷的一类遗传病，多为单基因遗传病，包括代谢大分子类疾病：包括溶酶体贮积症（30余种病）、线粒体病等；代谢小分子类疾病：氨基酸、有机酸、脂肪酸等。对新生儿特别是高危新生儿进行遗传性代谢病筛查,能够起到早发现、早诊断、早治疗的作用,从而有效降低本地区出生人口缺陷,为提高人口素质建立保障,是一种能够有效预防遗传代谢病的途径[1]。该病呈进行性加重，可导致神经系统异常等不可逆性损伤，因此对新生儿进行IMD筛査可对患儿进行早期干预及治疗，从而最大程度地降低该病的危害。新生儿疾病筛查是指医疗机构在新生儿中采用快速、简便、敏感的检验方法，对危及儿童生命、危害儿童生长发育、导致儿童残疾的先天性或遗传性疾病进行筛查，旨在早期发现疾病、早期治疗，减少儿童残疾甚至死亡。传统筛查方法（如Guthrie细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附实验等）属于“一种方法检测一种代谢疾病”，不仅费用高周期长，而且不适用于多种代谢疾病的群体筛查，难以满足大规模IMD筛查的要求。近年发展的串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MS/MS），能够一种方法检测多种代谢疾病，则有可能成为筛查遗传性代谢病的常规方法[2]。该方法能在2～3 min对1个标本进行多种产物分析，可同时进行多种IMD的筛查和诊断。本研究对419例新生儿（江苏省中西医结合医院146例及苏州市中西医结合医院273例）应用串联质谱技术进行遗传代谢性疾病的筛查，提高遗传代谢性疾病的筛查的认识和诊疗水平。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

甲醇（美国Tedia），水为超纯水；Perkin Elmer非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒（含氨基酸内标准品、酰基肉碱内标准品及干血斑质控品等）。

1.2 仪器

液质联用仪为Waters 2695-Quattro micro，工作站为Waters Masslynx及Waters Neolynx，微孔板恒温振荡器JN400-3（苏州吉米诺），Vortex-Genie振荡器，超纯水器（Millipore Inc.USA）。

2 资料与方法

2.1 一般资料

选取2014年3月—2015年11月江苏省中西医结合医院及苏州市中西医结合医院的419例新生儿（出生时间为72 h～7 d）作为研究对象，其中男婴251例，女婴168例。正常出生体质量389例，低体质量儿4例，巨大儿26例；足月儿243例，早产儿2例，过期儿174例。

2.2 研究方法

2.2.1 标本采集 所有新生儿在出生72 h内充分哺乳（哺乳至少6～8次）后进行采血。采血前先以75%乙醇给予充分消毒，选择婴儿足跟内侧或外侧，其方法是按摩或热敷婴儿足跟使其充血，酒精消毒后用一次性采血针穿刺，深约2～4 mm，弃用第一滴血后将其挤出，血液滴在特定的滤纸上，使其充分渗透至滤纸对面。每张滤纸片上留存2～3个直径为8 mm以上的血斑。血斑应充分渗透，浓度均匀一致。标本晾干后，统一收集标本，密封存放在2～10℃冰箱里保存待检，检查阳性者需复查以及基因诊断。

2.2.2 样品处理与测定 新生儿筛查中串联质谱法检测包括衍生化法和非衍生化法。本实验采用非衍生化法，采用Perkin Elmer非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒。用打孔器打下滤纸血点后置于96孔板中，加入内标液100 μL（含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇），用热封膜将96孔板封好后放入微孔板恒温振荡器，在45 ℃，700 r/min条件下振荡45 min，冷却并静置后吸取上清液75～85 μL于进样瓶，待反应2 h后进样，进行MS/MS分析。

2.2.3 色谱条件 色谱条件：流动相为甲醇-水相（80 : 20）；梯度洗脱，流速梯度变化见表1；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱流速时间表

质谱条件：新生儿疾病筛查的串联质谱分析，主要同步执行3个扫描模式：母离子扫描（PS）、中性丢失扫描（NL）和多反应检测扫描（MRM）。

母离子扫描（PS）：由于肉毒碱碰撞裂解产生m/z 85，分别可能为-C4H8、-N（CH3）3、-RCOOH的碎片，若采用母离子扫描模式，可获得所有酰基肉毒碱的信息。中性丢失扫描（NL）：由于氨基酸碰撞裂解大多会产生中性丢失质量m/z46的碎片，采用中性丢失扫描模式，可得多种氨基酸信息。多反应检测扫描（MRM）：可得部分碱性氨基酸，如鸟氨酸、瓜氨酸（m/zl19）、精氨酸（m/z161）、甘氨酸（m/z56）的信息。

分析物浓度的计算采用内标法：mi=f×Ai/（As/ms）

Ai和As：分析物和内标物的峰面积或峰高；ms：内标物的量；f：校正因子。

校正因子f的计算：f=（As/ms）/（Ar/mr）

As和Ar：内标物和对照品的峰面积或峰高；ms和mr：加入内标物和对照品的量。

通过软件Waters Neolynx计算分析物的浓度。

2.2.4 病种及截断值分析 本次串联质谱法筛查新生儿遗传代谢疾病共23个，参考浙江地区截断值，如表2所示。

表2 串联质谱筛查新生儿遗传代谢疾病病种及截断值

2.2.5 确诊和随访 将样本检测所得数据与浙江地区的新生儿筛查数据相比较，对于筛查阳性的样本进行原血片复查，若再次检测为阳性，则通知新生儿家属并发放串联质谱分析报告单，督促其到具备诊断条件的医疗机构进行诊断并治疗，同时对其电话随访。筛查流程见图1。

图1 筛查工作流程

3 结果

3.1 总体筛查情况

在筛查的419例样本中，原血片复查15例，此15例中3例为可疑阳性病例，分别是2例原发性肉碱缺乏症和1例中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症。我们及时告知这3例新生儿家属并发放报告单督促其尽快复查诊断。在随后对其的电话随访中，我们得知这3例的诊断结果均为正常。

3.2 质量控制

本次检测含质控样品4%，含低质控及高质控，检测误差都在20%之内，符合质控要求。

3.3 检测图谱

检测的3个离子通道色谱图如图2所示，分别为母离子扫描、中性丢失扫描和多反应检测扫描模式下的色谱图信息。

图2 离子通道色谱图

4 讨论

本实验串联质谱技术使用多种参数指示筛查结果，能够一次检测多种疾病，提高诊断效率，并且兼顾敏感性和特异性。虽然其已为近年来新生儿遗传代谢病筛查的发展趋势，但由于其仪器成本及对仪器使用者的要求都较高，同时也需要配备具有遗传代谢疾病领域临床经验的医生，因此，也一定程度限制了其应用。使用串联质谱技术进行新生儿遗传代谢病筛查的过程中，存在着一些影响筛查质量的因素，列举如下。

4.1 血样采集及实验室因素

血样采集是新生儿疾病筛查中比较重要的技术环节，包括标本的采集、贮藏和递送，其质量会影响到实验结果。采血过程中可能出现血斑太小、血液凝固、溶血、正反面滴血、血斑渗透不全、血斑污染、出现渗血环等问题；贮存条件不符合要求，由于受潮、日照或烘烤等因素，导致血样保存不当[3]。标本也有可能被甲醇、甲醛、甲苯、消毒剂、清洁剂等试剂污染或者由于夏季太阳暴晒、冬季暖气和火炉旁烘烤而变质；如不按要求冷链递送，标本同样可能出现问题从而影响筛查结果。或因于没有定期清洗消毒洗板机或试剂混合不均匀等人为因素而导致样本失控[4]。因此，筛查质控尤为重要，应尽量降低血片不合格率、不合格血片补采率以及血片迟递率[5]。

实验室的影响因素主要包括：实验仪器不符合标准；实验人员未曾接受新生儿疾病筛查相关实验室知识和技能培训或没有严格按照实验室标准操作规程操作；生物参考区间选择不科学；检测方法本身的问题等。

4.2 新生儿因素

由于新生儿出生后2～3个月酪氨酸会出现良性暂时性增高，串联质谱法对于酪氨酸血症、高胱氨酸尿症、甲基丙二酸尿症以及维生素B紊乱等疾病的检测假阳性率达0.2。另外，低出生体质量儿出现假阳性率明显高于正常出生体质量儿，这是因为早产、低体质量儿常存在肠道外营养，影响氨基酸及酰基肉碱浓度变化[6]。

4.3 切值

切值是指新生儿代谢物在健康人中的上限及下限值。遗传代谢病筛查指标切值设置尤为重要。切值若设置偏高则导致假阴性，若设置偏低则导致假阳性。新生儿筛查切值的确定需要建立在一定 数量足月健康新生儿、结合检测日期的质控值、疾病的患病率的基础上，取合适的百分位数作为切值的上下限[7-9]。由于新生儿筛查受影响因素较多，建议不同的新筛实验室在开始时选用试剂盒推荐切值或者其他实验室切值，等实验室样本量足够之后，建立自己的实验室切值范围并定期校正，从而不断优化截断值，提高阳性预测值，降低假阳性率[10]。

串联质谱技术用于新生儿遗传性代谢病筛查具有较高灵敏度及特异度，使用血量少，检测病种多，能够使患儿在机体损伤之前得到及时的诊断和治疗，可以显著提高新生儿生命质量，值得进行全面的推广和采用[11-12]，除此之外，遗传代谢病的早期诊断对指导家庭再生育、改善医患矛盾也是十分必要的。本文借助本院新生儿419例样本采用串联质谱技术建立了方法，同时讨论了影响新生儿筛查质量的几点因素，具有一定参考意义。串联质谱法作为新生儿疾病筛查的一项有力手段，使得使新生儿筛查的内容和质量上升到一个新的水平。随着人们对串联质谱法机理认识的重视以及其技术的日益成熟，将会大幅提升筛查率及阳性预测值，会有更多的疾病可以得到早期诊断和治疗[13]。