范晓丽，夏穗瑞，孙 莉

(桂林医学院药学院，广西 桂林 541199)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，主要特征表示为行动迟缓、静息性震颤等运动障碍和非运动障碍[1-2]。PD的发生受遗传、环境等因素影响，发病机制复杂，其中线粒体功能障碍在PD发生中具有重要作用[3]。研究表明，线粒体功能相关基因Parkin和PINK1的突变与家族性PD有关[4]。PINK1突变可导致线粒体功能受损，从而引起相关的神经毒性，进而引起细胞凋亡[5]。Wnt信号通路能调节细胞周期、生长和增殖[6]，并参与调控神经元的凋亡[7]。Wnt6是经典的Wnt信号传导分子，研究表明Wnt6参与胚胎早期发育和器官形成[8]，但其对帕金森病的作用尚不清楚。笔者探讨Wnt6对帕金森病果蝇的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料

果蝇品系W1118野生型、UAS-Wnt6 OE均购自美国Bloomington果蝇中心；果蝇品系UAS-PINK1B9/FM7-MHC-GAL4为中南大学医学遗传学国家重点实验室馈赠。

1.2 果蝇构建

构建MHC-GAL4/UAS系统的转基因果蝇。正常对照组： 将MHC-GAL4 处女蝇与W1118 雄蝇杂交，收取 F1 代，基因为(W1118/+； MHC-GAL4/+)的目标果蝇。PINK1B9疾病组： 将(UAS-PINK1B9/FM7； MHC-GAL4)的处女蝇与 W1118 雄蝇杂交， 收取 F1代，基因型为(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/+)。Wnt6 过表达(Wnt6 overexpression，Wnt6 OE)干预组： 将(UAS-PINK1B9/ FM7； MHC-GAL4)的处女蝇与UAS-Wnt6 OE 果蝇的雄蝇杂交，收取 F1 代，基因型为(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/Wnt6 OE)。

1.3 Real-Time PCR检测mRNA表达

每组30只转基因目标雄果蝇，第5天取其胸部组织，分别提取总mRNA，逆转录得cDNA，再以cDNA为模板，使用 7500 Fast Real-Time PCR System( Applied Biosystems) 仪器进行PCR反应，检测基因mRNA表达水平，引物序列如下：18S上游5’-TCTAGC AAT ATG AGA TTG AGC AAT AAG-3’，下游5’-AAT ACA CGT TGA TAC TTT CAT TGT AGC-3’；PINK1上游5’-GTG CCT TCA ATG TGA CTT CT-3’，下游5’-TGC TCT GGA TGT CGT AGT T-3’；Wnt6上游5’-TGC GTT TGC TCA TGG TAA TTG-3’，下游5’-TTG GAT CGA GAA GGA TGT TGG-3’，引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.4 果蝇形态学观察

随机挑选第5天的雄蝇，每组100只，置于挑蝇板上，CO2麻醉后，每5只装入1个透明的玻璃管中，视为一个观察单位，待果蝇1 h后完全苏醒。观察每组果蝇翅膀形态，并计算其异翅率；轻轻敲击玻璃管壁，观察果蝇的飞行能力，计数每管飞行果蝇数目，计算每组飞行率。重复至少3次。

1.5 Western blot检测蛋白表达

随机挑选第5天雄性目标果蝇，每组30 只，取其胸部，加入RIPA 组织裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂，提取总蛋白；经聚丙烯酰氨凝胶电泳后转移到 PVDF 膜上，5% 脱脂牛奶封闭；一抗Ndufs3(1∶1 000)、Wnt6(1∶1 000)、 内参Tubulin(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜；洗涤后，加入相应二抗(1∶5 000，中杉金桥)孵育；洗涤后，加化学发光试剂(Thermo Fisher 公司)发光， Image Lab 5.1 显影；PVDF膜扫描后用Image J 图像软件进行蛋白条带分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 PINK1 B9疾病果蝇和UAS-Wnt6 OE果蝇

PINK1B9疾病组，PINK1和Wnt6的mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)，见图1a-b；Wnt6 OE干预组，Wnt6的mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。UAS-Wnt6 OE果蝇中的Wnt6蛋白表达高于对照组，见图2a-b。

与正常对照组比较，*P<0.05图1 PINK1B9疾病组PINK1和Wnt6的mRNA表达

与正常对照组比较，*P<0.05图2 Wnt6 OE干预组Wnt6的 mRNA及蛋白表达

2.2 Wnt6对PINK1B9疾病组果蝇表型的影响

与正常对照组果蝇比较，PINK1B9疾病组果蝇出现明显的翅膀异常：下垂、竖立、残翅等，异翅率明显升高、飞行能力减弱(P<0.05)。与PINK1B9疾病组比较，Wnt6 OE干预组果蝇翅膀异常的表型明显改善，异翅率降低、飞行率提高(P<0.05)，见图3a-b。

与正常对照组比较，*P<0.05；与PINK1B9疾病组比较，#P<0.05图3 果蝇的异翅率和飞行率分析

2.3 Wnt6对PINK1B9疾病组果蝇线粒体复合物Ⅰ亚基关键蛋白的影响

与正常对照组相比，PINK1B9疾病组中 Ndufs3 蛋白的表达量明显降低(P<0.05)；与PINK1B9疾病组相比，Wnt6 OE干预组中Ndufs3蛋白表达水平升高(P<0.05)，见图4。

与正常对照组比较，*P<0.05；与PINK1B9疾病组比较，#P<0.05图4 Western blot 法检测Ndufs3蛋白表达

3 讨论

帕金森病(PD)是全球第二大神经退行性疾病，但病因及发病机制等仍不明确，研究表明线粒体功能障碍相关的神经毒性是帕金森病发病机制之一[9]。线粒体是细胞生命活动中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心[10]。相关基因突变对线粒体形态、功能具有重要影响[11]，如PINK1突变导致线粒体功能障碍、多巴胺能神经元变性伴随着果蝇模型的运动障碍[12]。

Wnt是一个分泌型糖蛋白家族，在细胞增殖、存活、迁移以及细胞的极性和自我更新的调节中具有重要作用。研究表明， Wnt信号异常可能是成年人神经退行性疾病的病因[13]。Wnt6是Wnt家族成员之一，与其他的Wnt蛋白一样，Wnt6也具有多种生理功能，如器官生成与胚胎发育等[8]。近年来Wnt6基因的研究主要集中在肿瘤，如食管癌和骨肉瘤等[14-15]，但在神经退行性疾病方面的研究很少。为了明确Wnt6对PINK1突变引起的帕金森病果蝇模型的作用，本研究构建了Wnt6过表达的PINK1B9疾病果蝇，观察其表型的变化。研究发现Wnt6过表达改善了PINK1B9疾病组果蝇的表型，异翅率降低，飞行运动能力提高。为进一步明确Wnt6过表达对PINK1B9疾病组果蝇的保护作用是否与改善线粒体功能有关，笔者检测了各组线粒体ComplexⅠ亚基Ndufs3蛋白的表达水平。结果表明，Wnt6过表达对PINK1B9疾病组果蝇的保护作用可能与改善线粒体ComplexⅠ的功能有关。但其涉及的具体机制及相关的通路尚不清楚，有待进一步探索。

综上所述，Wnt6过表达能改善PINK1突变果蝇的运动能力，这可能与改善线粒体ComplexⅠ的功能有关。