钟 娃， 夏忠胜， 于 涛， 倪楚燕， 黎洁瑶， 陈其奎

（中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东广州510120）

胰腺干细胞属于未分化细胞，具备分化为胰腺内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞的潜能，可以表达干细胞的一些分子标志，但尚未发现其特异性分子标志［1］。近年来研究认为，胰十二指肠同源异形框1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）是胰腺干细胞分子标志之一。Pdx1 是胰腺发育早期、β 细胞分化及成熟胰岛细胞中重要的转录因子［2］。Pdx1可以诱导内胚层向胰腺定向发育和成熟，其活化可促进胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖转运因子2 和胰岛淀粉样多肽等细胞重要基因的表达［3］。在胚胎发育早期，敲除Pdx1后导致小鼠胰腺发育不良［4］。在胚胎发育晚期，敲除Pdx1将影响 β 细胞的成熟，使小鼠糖耐量异常、血糖升高［5］。因此，Pdx1+细胞可以认为是胰腺的前体细胞。本研究采用Tet-On 系统构建稳定表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）株，实现Pdx1基因的定时、定点和定量表达，为下一步通过调控表达Pdx1诱导胰腺前体细胞分化奠定了基础。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞 小鼠ESC 名称：ES-E14TG2a；小鼠品系：129/Ola，购于 American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM 培养基（Gibco BRL）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于Biochrom；白血症抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）购于Millipore；限制性内切酶（NEB）；In-Fusion™PCR Cloning Kit（Clontech）；Taq polymerase（Sino-Bio）；Lipofectamine 2000、目的基因引物和 Trizol（Invitrogen）；293T 细胞、嘌呤霉素、强力霉素和大肠杆菌菌株DH5α（吉凯基因公司）；PrimeScriptTMRTPCR Kit 和 SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ（TaKaRa）；小鼠抗小鼠Pdx1 单克隆抗体（R&D）；Annexin V-FITC/PI 试剂盒（Becton Dickinson）；RNA 引物（上海生工生物技术有限公司）；羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG 和兔抗小鼠GAPDH 单克隆抗体（CST）。流式细胞仪（BD Biosciences）；LightCycler 480 荧 光 定 量 PCR 仪（Roche）；荧光显微镜（Olympus）。

2 方法

2.1 小鼠胚胎干细胞的培养 小鼠ESC 在无饲养层细胞……