其丽木格, 鄂 勇, 乌云达来, 李玉玲

(1.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院,内蒙古 呼和浩特 010022;2.内蒙古莫力达瓦达斡尔族自治旗人民医院,内蒙古 莫力达瓦旗 162850)

体型是人体骨骼、肌肉、体脂、身材等的综合反应,对青少年的生理机能、运动素质、心理情感、社会适应性发展及职业选择意向都有一定影响[1-2]。围度、身高及体重等测量指标,可从不同角度反映骨骼、脂肪的发育状况,而由各原始测量指标衍生的许多指数还可以综合反映身体各部位的比例和体型发育状况[2]。身高、体重作为我国学生最基础的指标在相关研究中一直广受重视,由其衍生的身体质量指数(body mass index,BMI)主要反映体型的胖瘦程度,间接反映营养状况,是目前国际上最广泛的一种评价肥胖的方法[3]。腰臀比(waist-hip ratio,WHR)是腰围与臀围的比值,可反映体内多余脂肪的分布特征。研究提示：腰围、WHR能很好地评价中心性肥胖[2]。近年来,随着人们生活水平的提高及生活方式的改变,肥胖已成为主要公共卫生问题。因此,与之相关的BMI、WHR在肥胖筛查中有着重要意义。

贾娜等[4]对66对7～16岁双生子研究发现,身高、体重的遗传度分别为0.84、0.77,提示身高、体重主要受遗传因素影响。Lise等[5]对加拿大、瑞典、丹麦和澳大利亚地区的3～19岁双生子研究发现,身高(0.40～0.95)、体重(0.48～0.94)和BMI(0.45～0.91)等指标的遗传度受遗传与环境的共同影响。张栋等[6]利用MX软件对11～19岁双生子的腰围和腰臀比遗传度的研究发现,青岛市青少年双生子腰围遗传度为0.08,WHR遗传度为0.53,提示腰围主要受环境因素的影响,腰臀比则与遗传、环境因素相关。Döring等[7]研究发现,儿童腰围发育以及肥胖程度与家长的饮食习惯密切相关,超重或肥胖的儿童成年后肥胖的风险更大,提示对儿童早期的环境干预是预防成年期肥胖的关键。因此,深入了解儿童体型相关指标的发育及其影响因素,对体型发育以及肥胖预防都具有重要意义。

目前,关于体型与肥胖相关基因的研究也日益受到重视。多巴胺是主要的儿茶酚胺类神经递质,控制着运动、认知、摄食、内分泌调节等多种功能[8-9]。根据多巴胺受体基因结构及药理性将其分为D1类和D2类受体两个大家族：D1类家族包括D1和D5受体亚型,D2样家族包括D2、D 3和D4受体亚型。目前国内外关于多巴胺D2受体基因(dopamine D2 receptor,DRD2)和多巴胺D4受体基因(dopamine D4 receptor,DRD4)与体型指标相关的研究较多,而多巴胺D 3受体基因(dopamine D 3 receptor,DRD3)的相关研究则相对较少。DRD3位于3q13.3,主要存在于伏隔核和纹状体[10],其序列变异可能引起受体结构或表达的细微改变,从而导致不同的表型。研究发现,DRD3基因的变异可能会引起多巴胺敏感性改变,进而导致与进食相关的愉悦感降低[11]。Berridge[12]研究发现,投射到腹侧纹状体伏隔核的中脑多巴胺神经元与食物和药物奖励密切相关,有可能影响所消耗的能量。此外,也有研究表明DRD3与药物及酒精成瘾有关[13]。一项研究表明,三种DRD3基因型可以预测注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)症状,而ADHD与肥胖率和暴饮暴食症状密切相关[14]。Avena等[15]研究发现,一些肥胖人群对糖的渴望类似于药物成瘾,而DRD3被认为在心理刺激的奖励作用中起着直接作用,因此这一类人的摄食量比普通人更大,从而导致体内脂肪堆积,一定程度上导致肥胖。目前关于多巴胺与身心发育有关的研究受到广泛的关注[16-17],但在国内外研究中还未发现DRD3基因多态性与体型相关指标的研究,有些机制还需进一步研究。

本文拟以双生子儿童为研究对象,在分析各指标遗传度基础上,以DRD3基因SNP为遗传标记,初步探讨遗传因素对儿童体型相关指标的影响,提供分子生物学资料,为今后深入分析其影响因素奠定基础。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

在父母及学生知情同意情况下,以学校为单位,在呼和浩特市和包头市募集160对4～12岁双生子。每对双生子均共同生活,就读于同一所学校,身体健康。其中同卵双生子(monozygotic,MZ)68对,男34对,女34对; 异卵双生子(dizygotic,DZ)92对,均为同性别双生子,其中男44对,女48对。为了解不同发育期对各体型相关指标的遗传效应的影响,本文在分析遗传度时将4～12岁双生子儿童分为学龄前期(4～6岁)和学龄期(7～12岁)两个年龄组。

1.2 研究方法

1.2.1 体型相关测量指标 依据《人体测量方法》[3]测量各项指标,测量前统一标准,并保证每对双生子的测量在同一时间段内完成,包括身高、体重、腰围、臀围4项体型指标。根据体格原始测量指标计算身体质量指数(BMI)和腰臀比指数(WHR),公式分别为IBM=(M/H2)×104和RWH=(W/C)×100。其中,M为体重(kg),H为身高(cm),W为腰围(cm),C为臀围(cm)。

1.2.2 全基因组DNA提取 使用一次性口腔拭子刮取双生子口腔上皮细胞,利用TIANamp Swab DNA Kit(TIANGEN BIOTECH,Beijing,China)试剂盒提取全基因组DNA。

1.2.3 卵型鉴定 利用Amp FISTR Sino filerPlus试剂盒(PE Applied Biosystems Inc,Perkin Elmer,Foster City,CA,USA)对16个STR位点(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D 3S1358、D12S391、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、D6S1043、D5S818、D18S51、FGA、性别鉴定Amelogenin)的一致性进行鉴定。

1.2.4DRD3基因单核苷酸多态性检测 采用SNaPshot技术测定4个SNPs位点基因型。利用Pre-mier 3.0 设计SNP位点的上下游引物; 应用PTC-100PCR仪对每个SNP位点进行扩增; 采用SNaPshot SNP分型技术进行SNP分型; 在1个含有测序酶、4种荧光标记的ddNTP、在邻近SNP位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经3730xl型测序仪测序,根据峰的颜色可知掺入碱基的种类,从而确定样本的基因型,根据峰的移动位置可确定该延伸引物对应的SNP位点。

1.2.5 统计分析方法 采用Epidata 3.0录入数据,双核查逻辑检错。使用统计软件SPSS 18.0进行统计处理; 两类双生子各指标性别间差异性由独立样本t检验完成。对各指标进行正态性检验,对不符合正态分布的体重、腰围、臀围、WHR、BMI进行对数(lgx)转换。根据最大似然法原理,采用MX软件拟合最佳结构方程模型,估算遗传度。用GEE模型分析DRD3基因单核苷酸多态性与双生子儿童体型指标的相关性。使用Haploview 4.2进行连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)检验。同卵双生子、同性别异卵双生子对内方差和对间方差齐性检验用F检验,组内相关系数检验用Z检验。相关公式如下:

2 结果

2.1 各指标对内方差、对间方差及组内相关系数比较

矫正年龄后,同性别双生子各指标对内方差、对间方差以及组内相关系数比较发现,男、女各指标的对内方差均为MZ>DZ,男、女各指标均存在显著差异(P<0.05),如表1所示。男、女各指标的组内相关系数均为rMZ<2rDZ,提示结构方程模型分析时可拟合ACE模型[2]。

表1 4～12岁男、女生双生子儿童各指标对内、对间方差及组内相关系数比较

2.2 不同发育期双生子儿童体格指标遗传度分析

运用MX软件进行模型拟合,结果如表2所示。4～12岁男、女两类双生子各指标最佳模型均为ACE模型,拟合优度(P>0.05)均较好,表明学龄双生子儿童体型相关指标受遗传与环境的共同影响。其中,身高、学龄前期BMI、学龄前期腰围、学龄期臀围、学龄期WHR拟合的最佳模型为模型VI,男、女遗传度相等,但男性共同环境效应为女性的k倍(cm=kcf); 体重、学龄期腰围、学龄前期WHR最佳模型为模型IV,男、女共同环境效应相等(cf=cm); 学龄期BMI、学龄前臀围的最佳模型为模型II,不存在男孩特异的加性遗传方差(a’m=0)。

结果显示(表2),女生除臀围(学龄前0.22,学龄期0.72)外,其余各指标遗传度均为学龄前期高于学龄期; 男生各指标遗传度均为学龄前期高于学龄期。学龄前期男生臀围(0.86)、WHR(0.71)遗传度分别高于女生学龄前期臀围(0.22)、WHR(0.51),学龄期男生体重(0.70)、腰围(0.54)等指标遗传度高于女生学龄期体重(0.47)、腰围(0.27); 其余指标在同发育阶段遗传度男女相等。

表2 两个发育期体格指标及衍生指标的最佳模型

2.3 DRD 3基因SNP与双生子儿童体型指标相关性分析

采用广义估计方程模型分析DRD3基因SNP与体型相关指标的相关性。为避免样本流失,将一对双生子设为重复测量数据,其中主体变量为编号,主体内变量为出生顺序,选择Unstructured工作相关矩阵,分别以双生子体格指标为因变量,以基因型为自变量,选择Linear分析方法进行分析,结果见表3。

结果显示,DRD3基因4个SNP与BMI无相关性(P>0.05)。体重分别与rs167771、rs226082存在相关(P<0.05),rs167771携带G等位基因个体的体重值高于AA基因型的个体,rs226082携带C等位基因个体的体重值高于TT基因型的个体; 身高与rs324029存在相关(P<0.05),rs324029携带G等位基因个体的身高值低于AA基因型的个体; 腰围与rs167771存在相关(P<0.05),rs167771携带GG基因型个体的腰围值低于携带A等位基因的个体; 臀围与rs226082存在相关(P<0.05),CT基因型个体的臀围值高于CC基因型和TT基因型等纯合子个体; WHR分别与rs324029、rs167771、rs226082存在相关(P<0.05),rs324029的AA基因型个体WHR值高于携带G等位基因的个体,rs167771携带A等位基因个体的WHR值高于GG基因型的个体,rs226082的CC基因型个体的WHR值低于携带T等位基因的个体。统计发现rs2134655与六个指标均无相关关系。

2.4 DRD 3基因4个SNPs位点连锁不平衡分析

根据DRD3基因多态性4个SNP位点的位置分布情况,使用Haploview分析软件计算等位基因的连锁不平衡系数D′、r2,检验基因的连锁强度。当D′和r2的取值为0时,表示位点间连锁达到完全平衡; 当D′和r2的值越接近于1,表示越趋于连锁不平衡; 当D′和r2的值等于1时,表示位点间连锁完全不平衡。连锁不平衡系数D′以描述LD水平,相关程度系数(r2)值以反映两位点关联的显著性水平,根据文献分别将其定为r2>0.8且D′>0.7进行连锁不平衡分析[18-19]。

表3 DRD 3基因多态性与双生子儿童体型相关指标的相关性分析

续表3 DRD 3基因多态性与双生子儿童体型相关指标的相关性分析

图1 4～12岁双生子儿童DRD 3受体基因SNPs不平衡图

结果显示(图1),rs2134655与rs167771之间为(D′=1.0,r2=0.045),rs167771与rs226082之间为(D′=0.097,r2=0.001),rs226082与rs324029之间为(D′=0.578,r2=0.286),rs2134655与rs226082之间为(D′=0.436,r2=0.022),rs2134655与rs324029之间为(D′=0.741,r2=0.061),rs167771与rs324029之间为(D′=0.146,r2=0.009),表明本研究中4个SNP间连锁强度较弱。

3 讨论

双生子研究是阐明遗传与环境因素对人类表型相对效应的最佳方法,用MX软件拟合最佳模型估算遗传度,能更加充分利用双生子资料,使结果更加精确[2]。有研究发现,体格指标的遗传效应存在一定的性别、年龄或发育期及族群差异[20-21]。本研究发现,男、女生体重、腰围、臀围、WHR等指标的遗传度存在一定性别差异,且男生的遗传度多数高于女生,女生更易受环境因素的影响; 除女生臀围外,其余各指标男女遗传度均为学龄前期高于学龄期,提示儿童不同发育期体型相关指标受遗传与环境因素影响程度不同。

李小燕等[22]采用Holzinger的改良遗传度计算法(h2)对合肥市60对4～14岁儿童的研究发现,身高遗传度0.71,体重遗传度0.54,与本次研究中学龄期儿童身高遗传度一致,而体重遗传度与本研究中女生遗传度较接近,而与男生差异较大。张栋等[23]利用MX软件对青岛11～19岁双生子儿童少年遗传度计算发现,BMI遗传度男女均为0.75,略高于本研究中学龄期儿童的BMI遗传度,造成该结果可能与本研究分性别计算遗传度有关。栾天抒等[24]采用MX软件对内蒙古自治区呼和浩特市和包头市3～6岁双生子儿童的研究发现,腰围遗传度(男生0.77、女生0.72)略低于本文学龄前儿童的研究结果,臀围遗传度(男生0.49、女生0.62)与本研究略有差异,这可能与样本构成有关,本研究中不包含异性别异卵双生子。Lee等[25]对青岛、丽水成年双生子的研究发现,腰围的遗传度(0.75)和WHR的遗传度(0.61)与本研究结果均有不同,可能与两个样本的年龄构成不同有关。金佰明等[26]采用Holzinger改良遗传度计算法对齐齐哈尔市25周岁及以上双生子的研究发现,WHR遗传度为0.42,与本研究中学龄期儿童WHR的遗传度一致。季成叶[27]指出,遗传度只是一个描述性统计量,不同群体有不同遗传度,同一群体在不同生长发育期遗传度也不同,遗传度还受种族、族群、地区影响。总体而言,本研究中多数体型相关指标的遗传度与国内外同年龄段的相关研究结果接近,但与成年人的研究结果差异较大,提示年龄或发育期可能是影响遗传度的因素之一。

本研究初步发现,体重分别与rs167771、rs226082存在相关,身高与rs324029存在相关,腰围与rs167771存在相关,臀围与rs226082存在相关,WHR分别与rs324029、rs167771、rs226082存在相关; 而BMI与本研究探讨的DRD3基因各SNP均无相关性。多巴胺是中枢神经系统中主要神经递质,可以通过中脑边缘奖励机制调节食物摄取量。DRD3在伏隔核与纹状体内大量表达,这个区域与奖励、成瘾与行为密切相关,有研究表明DRD3与暴饮暴食症有关联。这一类人对食物有着冲动行为[28],一些肥胖人群特别是暴食症患者,可能会对影响健康的美味食物产生不健康的依赖,从而产生食物成瘾[14]。有研究表明,某些人感觉寻求的改变与DRD3基因rs167771的变异有关[29]。关于DRD3基因与食物摄入的报道较多,但与体型相关指标直接相关的研究尚未发现。

本研究以学龄前及学龄双生子为研究对象,报道了4～12岁儿童体型相关指标的遗传度,初步探讨了DRD3基因4个SNP对各指标的影响,研究结果对于深入了解双生子儿童体型发育特点,以及遗传与环境因素的相对效应具有一定的理论意义,也可为儿童制定肥胖预防措施、改善儿童饮食行为等研究提供一定科学依据。