梁 猛，周今朝，孙训英，贺超凡，张克甲，胡 柯

蚌埠医学院生命科学学院，安徽 蚌埠 233030

雌激素双酚A（BPA）是由两个不饱和酚环组成的单体，其结构与己烯雌酚类似，具有弱雌激素活性［1-4］。BPA与雌性生殖细胞的分子功能存在显著关联，其能够降低卵母细胞质量，影响减数分裂，进而调控卵母细胞发育［5-8］。BPA暴露显著促进小鼠卵巢组织中凋亡相关的支架附着因子B样转录调节蛋白表达，进而抑制小鼠卵泡发育［9］。BPA能够阻止小鼠有腔卵泡颗粒细胞G2期向M期过渡，诱导细胞凋亡［10］。哺乳动物腔前卵泡颗粒细胞对于卵泡早期发育的激素及营养物质调控至关重要，而关于BPA对小鼠腔前卵泡颗粒细胞的调控研究，目前暂无报道。本研究通过体外培养腔前卵泡颗粒细胞和孕鼠体内暴露模型，探讨BPA对腔前卵泡颗粒细胞和孕鼠及子代雌鼠卵巢的影响。深入研究不同BPA浓度暴露对于对体外卵巢腔前卵泡颗粒细胞功能和孕鼠及子代雌鼠卵巢发育调控，将揭示BPA对早期卵泡发育的浓度依赖分子机制，并为临床制定有效的预防措施提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂

FBS、双抗和 DMEM/F12（Life Technologies），CCK-8（Dojindo Laboratories），胰酶，细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、BCA试剂、SDS-PAGE凝胶和JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天），Protease inhibitor cocktail（Roche），RIPA 裂解液（Millipore），Trizol试剂（Invitrogen），PrimeScriptTMRT reagent kit和TBGreenTMPremixExTaqTMII kit（TaKaRa）。

1.2 动物和细胞

ICR雌鼠由蚌埠医学院实验动物中心提供，选取10～12 d雌鼠分离卵巢腔前卵泡颗粒细胞［11］，选取怀孕8 d孕鼠进行BPA（索莱宝）体内暴露实验。分离出的颗粒细胞培养在5% CO2和37℃培养箱中，所用培养基为添加10% FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基中培养。将BPA用茶油溶解，以检测到阴道栓作为受孕第1天，从小鼠受孕第8天开始，根据孕鼠质量进行特定剂量BPA的灌胃处理，持续1周，以后正常饲养。本研究经过蚌埠医学院实验动物伦理委员会批准。

1.3 细胞增殖检测

为了研究BPA对腔前卵泡颗粒细胞的增殖效应，将细胞传至96孔板培养24 h，用不同浓度BPA处理48 h后，加入CCK-8试剂孵育2 h，使用酶标仪读取450 nm吸光度来测定细胞增殖情况。

1.4 细胞周期检测

腔前卵泡颗粒细胞传至6孔板培养24 h，给予不同浓度的BPA进行处理48 h，每孔加入0.5 mL胰酶进行贴壁细胞的消化，3 min后加入细胞培养液终止消化并收集细胞，再用预冷PBS洗涤并收集细胞。预冷70%乙醇重悬细胞，轻轻颠倒混匀，4℃固定3 h，离心收集细胞。按照细胞周期检测试剂盒说明书配制所需体积的染色液，向样品中加入0.5 mL染色液，37℃避光染色30min，利用流式细胞仪检测细胞周期情况。

1.5 细胞凋亡检测

腔前卵泡颗粒细胞传至6孔板培养24 h，给予不同浓度的BPA进行处理48 h，胰酶消化3 min，用移液器将各孔中悬浮细胞以及贴壁的细胞转移至离心管中，预冷PBS洗涤细胞2次。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书，向样品中加入100 μL的染色结合液（1X）轻轻吹打重悬细胞。再向细胞样品中加入5 μLAnnexin V-FITC，然后加入10 μLPI，室温避光染色15 min。最后向每管加入0.5 mL的染色结合液（1X）重悬，利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 JC-1线粒体膜电位检测

腔前卵泡颗粒细胞传至6孔板培养24 h，给予不同浓度的BPA进行处理48 h，弃掉培养液，PBS洗涤细胞1次，再向每孔加入1 mL细胞培养液。按照JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书，每孔加入1 mLJC-1工作液，充分混匀，37℃避光染色20 min。染色结束后弃上清，预冷JC-1染色缓冲液（1X）洗涤2次，每孔加入2 mL细胞培养液，荧光显微镜拍照。

1.7 Westernblot

通过含有1% Protease inhibitor cocktail的RIPA裂解液提取腔前卵泡颗粒细胞的总蛋白，使用BCA试剂测定蛋白浓度，确定上样量。配置SDS-PAGE凝胶，上样后进行电泳（80V20min，然后切换成120V70min），用工具将凝胶取出，切去浓缩胶，放入转膜槽中进行转膜（300 mA 90 min）。转膜结束后，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜液清洗1次，一抗4℃冰箱孵育过夜。将孵育过夜的膜用洗膜液洗涤3次（每次10 min），二抗室温孵育1 h，再用洗膜液洗涤4次（每次10 min），最后使用凝胶成像仪（Bio-rad）采集图像。

1.8 实时荧光定量PCR（qPCR）

Trizol试剂提取小鼠卵巢组织的总RNA，整个实验过程严格在无RNA酶环境中进行，操作步骤参考试剂说明书。使用PrimeScriptTMRT reagent kit将所提取组织的总RNA逆转录获得cDNA，再利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII kit进行qPCR检测分析。以β-actin mRNA为内参，检测Bcl-2mRNA表达水平。Bcl-2和βactin的引物序列如下：Bcl-2 Fw：CTGAGTACCTGAA CCGGCAT，Bcl-2 Rv：GGTATGCACCCAGAGTGAT G，β-actin Fw：TTCTACAATGAGCTGCGTGTG，βactinRv：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA。

1.9 卵巢组织HE染色

取小鼠卵巢组织块，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（5 μm），并进行石蜡切片脱蜡和水化，苏木素染液染色，再进行脱水和透明，中性树胶封片，最后显微镜观察并拍照。

1.10 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据统计处理，并以平均数±标准差表示，用单因素方差分析组间差异性，P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BPA调控腔前卵泡颗粒细胞增殖

通过体外分离培养卵巢腔前卵泡颗粒细胞，利用不同浓度的BPA处理，发现与对照组比较，低浓度BPA（50μmol/L）能够显著促进细胞增殖，而高浓度BPA（200和500μmol/L）能够明显抑制细胞增殖（图1）。

图1 Bisphenol调控腔前卵泡颗粒细胞增殖Fig.1 Bisphenol regulates proliferation of preantral follicular granulosa cells.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of Bisphenol.*P＜0.05 vs controlgroup.

2.2 BPA调控腔前卵泡颗粒细胞凋亡

通过流式细胞仪检测细胞周期，发现不同浓度BPA处理对细胞周期无显著差异（图2）。

图2 BPA对腔前卵泡颗粒细胞周期无显著影响Fig.2 Bisphenol(BPA)has no significant effects on cell cycle of preantral follicular granulosa cells.A:Flow cytometric analysis of cell cycle of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of BPA.B:Cell cycle distribution of the treated cells.

流式细胞仪检测不同浓度BPA处理腔前卵泡颗粒细胞凋亡情况，发现与对照组相比，低浓度BPA（50 μmol/L）能够显著抑制细胞凋亡，而高浓度BPA（200μmol/L）能够明显促进细胞凋亡（图3）。

图3 BPA调控腔前卵泡颗粒细胞凋亡Fig.3 Bisphenol(BPA)regulates apoptosis of preantral follicular granulosa cells.A:Flow cytometric analysis of apoptosis of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of BPA.B:Quantitative analysis of apoptotic cell rates.*P＜0.05vs control group.

2.3 BPA调控腔前卵泡颗粒细胞线粒体膜电位

免疫荧光结果显示，与对照组相比，低浓度BPA（50μmol/L）红色荧光显著增强，高浓度BPA（200μmol/L）绿色荧光显著增强（图4A）。流式细胞仪检测结果显示，低浓度BPA（50 μmol/L）红色荧光和绿色荧光的比值显著增加，高浓度BPA（200 μmol/L）红色荧光和绿色荧光的比值明显降低（图4B、C）。

图4 BPA调控腔前卵泡颗粒细胞线粒体膜电位Fig.4 Bisphenol(BPA)regulates mitochondrial membrane potential of preantral follicular granulosa cells.A:Immunofluorescence assay of mitochondrial membrane potential in preantral follicular granulosa cells treated with BPA.B:Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential of the cells.C:Quantitative analysis of mitochondrial membrane potential in different groups.*P＜0.05vscontrol group.

2.4 BPA调控凋亡相关蛋白表达

低浓度BPA（50 μmol/L）促进凋亡负调控蛋白Bcl-2表达，抑制凋亡正调控蛋白Bax和p53表达；高浓度BPA（200 μmol/L）抑制凋亡负调控蛋白Bcl-2表达，促进凋亡正调控蛋白Bax和p53表达；低浓度BPA（50 μmol/L）和高浓度BPA（200 μmol/L）对细胞周期蛋白CyclinD1均无显著影响（图5）。

图5 BPA调控凋亡蛋白表达Fig.5 Bisphenol(BPA)regulates apoptotic protein expression.A:Western blotting of Bel-2,Bax,p53,and cyclin D1 expressions in preantral follicular granulosa cells treated with different concentration of BPA.B:Quantitative analysis of the protein expressions.*P＜0.05vscontrol group,**P＜0.01vscontrol group.

2.5 体内BPA暴露对孕鼠及子代雌鼠卵巢发育的影响

为了深入探究BPA在体内对卵巢发育的影响，根据体外效应显著的BPA浓度（50和200 μmol/L），利用摩尔浓度和质量浓度关系，并参考Wei et al.研究［12］，换算成小鼠使用浓度（10和35 mg/kg），通过灌胃处理ICR孕鼠1周进行体内BPA暴露，之后检测孕鼠及子代雌鼠卵巢发育情况（图6A）。从BPA处理孕鼠开始记录孕鼠体质量变化，发现与对照组相比，BPA（10和35 mg/kg）处理组的孕鼠体质量增加较快，并且子代出生后母鼠体质量仍有差异（图6B）。对不同天数子代卵巢进行HE染色，结果显示在21 d时高剂量BPA（35 mg/kg）能够使卵泡发育加速进入有腔卵泡阶段（图6C）。通过分析子代雌鼠卵巢指数，发现在10 d时低剂量BPA（10 mg/kg）显著增加卵巢指数，在17 d时高剂量BPA（35 mg/kg）显著增加卵巢指数，21 d时低剂量和高剂量BPA（10 mg和35 mg/kg）均能显著增加卵巢指数，随着子代天数的增加，这种效应逐渐减弱（图6D）。qPCR结果显示，凋亡负调控蛋白Bcl-2表达与子代卵巢指数的变化基本一致（图6E）。

3 讨论

BPA在机体卵泡液、胎盘组织、尿液及血液等组织，可以干扰卵泡发育，与流产、多囊卵巢综合征和不孕等疾病密切相关［12-16］。本研究揭示，BPA能够通过调控卵巢腔前卵泡颗粒细胞线粒体膜电位，影响细胞凋亡，进而对细胞发挥重要功能，同时其作用具有浓度依懒性；体内暴露实验证明，BPA对孕鼠和子代雌鼠卵巢发育具有潜在影响。

BPA对细胞功能的调控，具有细胞种类和浓度依懒性。BPA能够诱导前列腺癌细胞周期停滞，主要通过激活EGFR/ERK信号通路［17］。BPA通过上调CyclinD1等细胞周期基因表达，加速G1/S期转化，进而促进乳腺癌细胞增殖［18］。BPA能够减弱甲状腺素诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡［5］。BPA可以通过雌激素受体途径刺激HBL-100细胞增殖和细胞分裂［19］。本研究揭示，在体外培养的卵巢腔前卵泡颗粒细胞中，低浓度BPA（50μmol/L）促进凋亡负调控蛋白Bcl-2表达，抑制凋亡正调控蛋白Bax和p53表达，升高线粒体膜电位，抑制细胞凋亡，从而促进细胞增殖；高浓度BPA（50 μmol/L）抑制凋亡负调控蛋白Bcl-2表达，促进凋亡正调控蛋白Bax和p53表达，降低线粒体膜电位，促进细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。体外实验结果证明，BPA对于卵巢腔前卵泡颗粒细胞功能调控具有显著的浓度依懒性。

研究报道BPA在体内能够发挥效用，引起动物组织不同程度损伤［20-22］。BPA通过激活ERK1/2途径诱导心脏纤维化，其是众所周知的诱导脂肪形成的致肥胖物［23-24］。成年雄性小鼠BPA暴露能够使得肺部的嗜酸性粒细胞异常，导致肺部损伤［25］。BPA能够通过阻断RNA剪接，导致后代雄性小鼠睾丸发育异常［26-27］。BPA还能够破坏生殖细胞减数分裂过程中双链断裂修复机制，导致染色体分离异常，从而引起一系列生殖疾病［28-30］。本研究证明，在孕鼠BPA体内暴露中，BPA（10和35 mg/kg）显著增加孕鼠质量，并增加子代雌鼠卵巢指数，凋亡负调控蛋白Bcl-2表达与子代雌鼠卵巢指数变化基本一致，高剂量BPA（35 mg/kg）能够促进21 d子代雌鼠卵泡发育加速进入有腔卵泡阶段。随着子代天数的增加，这一系列效应逐渐减弱。体内实验结果证明，BPA暴露能够加快孕鼠体质量升高和增加子代雌鼠卵巢指数。对于BPA在体内详细的代谢过程及分子机制，有待于将来的深入研究。

综上所述，本研究利用体外和体内实验，证明BPA对体外卵巢腔前卵泡颗粒细胞功能调控具有浓度依懒性，对孕鼠和子代雌鼠卵巢发育具有潜在影响。