杨 倩，戚 超，徐 婷，姚春艳

陆军军医大学第一附属医院输血科，重庆 400038

ABO血型系统是人类最重要的血型系统，除了A型、B型、O型、AB型这4种常见血型外，还有一些罕见的抗原较弱的亚型，比如B(A)血型[1]。B(A)血型在人群中的出现频率约为1/50万，该人群血清中存在高度活性的B型糖基转移酶，同时也存在少量的A型糖基转移酶，因此，其红细胞上不仅存在B抗原，还存在很弱的A抗原[2]。B(A)血型被认为是遗传学上的B型，血清学检测结果多表现为AB型，严重影响血型鉴定的准确性和输血安全[3-4]。本文对1例B(A)血型正反定型不符的患者进一步行血清学及分子生物学检测，同时对其进行了家系调查分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 先证者，秦某，31岁，女，汉族，原发不孕，无输血史，术前血型检查中发现常规血清学鉴定正反定型不符。经患者及其父母同意后，笔者对该患者进行了分子生物学分析及家系调查。

1.2仪器与试剂 主要仪器：LC-10C血库配血专用离心机(安徽中科中佳)，FQD-96A荧光定量PCR检测系统(杭州博日科技)，3130基因测序仪(美国ABI)。试剂：单克隆抗-A、抗-B血型定型试剂(上海血液生物20171023)，单克隆抗-H、抗-A1定型试剂(江苏力博20180918)，人ABO血型反定型用红细胞试剂(江苏力博201807006)，抗体筛查细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号(江苏力博201808009)，DNA提取试剂盒(江苏中济万泰生物)，人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒(江苏中济万泰生物)，ABO1-7外显子测序试剂盒(江苏中济万泰生物)。

1.3方法

1.3.1血型鉴定 采用试管法进行ABO血型血清学鉴定，采用抗人球蛋白法进行先证者血清的抗体筛查试验和抗人球蛋白试验。以上操作参照《全国临床检验操作规程》(第3版)[5]进行操作。

1.3.2DNA提取 使用DNA提取试剂盒(江苏中济万泰生物)快速抽提乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血中的基因组DNA，DNA标本水平为60 ng/mL，纯度为1.6～2.0(A260/A280)。

1.3.3ABO基因分型 采用荧光定量PCR法进行ABO基因分型(采用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒)，按照试剂盒说明书进行检测。

1.3.4ABO基因第6、7外显子直接测序 采用ABO1-7外显子测序试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1血清学鉴定结果分析 先证者及其父母的血型血清学鉴定结果见表1。通过血清学鉴定试验发现，先证者父亲为A型，母亲为B型，先证者为可疑B(A)型。先证者的血清学检测结果不符合遗传定律，因此需要进一步对该家系进行分子生物学检测。

2.2抗体筛查及抗人球蛋白试验结果分析 先证者及其父母的抗体筛查试验结果均为阴性，排除存在ABO血型系统以外不规则抗体的可能性；直接抗人球蛋白试验结果均为阴性，表明不存在红细胞上黏附的自身抗体对血型正定型造成干扰的现象；间接抗人球蛋白试验结果均为阴性，可排除血清中存在干扰反定型检测的不利因素。

2.3ABO基因分型结果分析 通过荧光定量PCR法进行ABO基因分型检测，A、A205、B、O(261G缺失)、O1、O2特异性引物只扩增引物3′末端的第1个碱基互补的等位基因，而不扩增不互补的等位基因，1次扩增就可以区分ABO的等位基因。PCR掺入染料法将荧光染料通过掺入DNA的扩增产物来表示DNA的扩增效果。在扩增后进行熔解曲线分析，通过熔解曲线分析能确认目的产物是否被特异性扩增，以此判断ABO的等位基因。从熔解曲线来看，先证者B基因和O02基因被特异性扩增，先证者父亲A基因和O02基因被特异性扩增，先证者母亲只有B基因被特异性扩增，故先证者的基因分型结果为BO02，其父亲的基因型结果为AO02，其母亲的基因型结果为B/B。

表1 先证者及其父母ABO血型血清学检测结果

2.4ABO基因第6、7外显子直接测序结果分析 对ABO基因的第6和第7外显子直接测序，发现先证者及其母亲存在261G/delG、297A/G、526G/C、640A/G、646T/A、657C/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C/A、803G/C、829G/A和930G/A杂合。与标准序列比对，发现先证者存在B(A)04等位基因640A>G突变。先证者及其父亲存在特征性721C>T杂合，经与血型抗原基因突变数据库比对，未发现有相同突变位点的O型等位基因，表明先证者及其父亲均含有1条新的O型等位基因。见表2。

表2 先证者及其父母ABO基因第6、7外显子直接测序结果

2.5ABO基因突变位点截图 见图1。

注：A、B为先证者特异性突变位点；C为先证者父亲特异性突变位点；D为先证者母亲特异性突变位点。

2.6家系调查 先证者家系的血型基因分型结果见图2。

图2 先证者家系的血型基因分析

3 讨 论

ABO血型基因共有7个外显子和6个内含子，位于第9号染色体长臂3区4带1、2亚带(9q34.1～9q34.2)[6-7]，核苷酸序列高度保守，等位基因之间只有几个核苷酸的差异，具有高度同源性。其中第6、7外显子约占编码区长度的77%，编码91%的糖基转移酶活性区域[8]，决定着ABO基因一级产物糖基转移酶的催化活性与性质。糖基转移酶活性的减弱或特异性改变将最终导致A或B抗原的减弱或转变，从而产生ABO亚型[9-10]。

ABO血型正定型的凝集强度通常应为3～4个“+”，反定型则应该至少超过2个“+”，若结果异常，则判定为正反定型不符，应该从标本及试剂质量、红细胞亚型、疾病(导致抗原或抗体减弱)等因素进行全面分析[11]。在本研究中，先证者的标本经过2次采集，病史回顾无特殊。正定型试验中，红细胞表面的A抗原较弱，B抗原正常，H抗原增强；反定型试验中，血清与A1细胞凝集，为4个“+”，与B细胞不凝集,结果判定为正反定型不符。为明确其血型，进一步对先证者进行了家系调查。

先证者父亲的基因分型结果为AO02，测序结果有突变位点721C>T杂合，结合血清学结果抗-A 4个“+”，推断其一条等位基因为A102，另一条等位基因为O02的新基因型(721C>T)。先证者母亲的基因分型结果为B/B，测序结果有突变位点640A>G杂合，其一条等位基因为B(A)04(640A>G)，另一条等位基因为B101。先证者的基因分型结果为BO02，测序结果有突变位点640A>G杂合，721C>T杂合。从家系分析推断：先证者一条等位基因为B(A)04(640A>G)，另一条等位基因为O02的新基因型(721C>T)。先证者存在的nt640 A>G错义突变使214位甲硫氨酸被缬氨酸置换，从而导致了B等位基因具有编码A抗原和B抗原双功能活性酶的能力[11]。对于另一条O02的新基因型(721C>T)等位基因，从先证者及其父亲的血清学检测结果来看，此突变可能为同义突变，不具有生物学意义。由此判断先证者血清学正反定型不符是由640A>G突变引起的。对于先证者母亲，测序基因型为B(A)04/B，但其血型血清学结果显示正反定型相符，并没有表现出较弱的A抗原。可能的原因有两个：(1)此基因型表现为大量的B抗原和极少量的A抗原，在血清学试验中极少量的A抗原被大量的B抗原掩盖，故正定型为B型。(2)国产的单克隆抗体试剂存在对B(A)血型的漏检现象。存在这种现象的原因是单克隆ABO血型定型试剂采用杂交瘤技术生产，针对的是1种血型抗原的单个抗原决定簇，无法识别所有的ABO血型抗原，尤其是ABO血型系统的弱A、弱B抗原。B(A)亚型抗原表位上功能基因的不同、位置的差异，甚至立体构象的变化等，都无法被单克隆抗体识别，从而出现漏检的情况[1]。

在日常实验室工作中，若遇到血清学方法无法确定的疑难血型标本，应采用基因分型技术进一步鉴定，必要时需进行家系调查，以确保结果的准确性，保障临床用血安全。