雷 雪，林勇平，向 波，杜丽枝，邓湘雪，刘斯琦，林润培，刘忠民△

1.广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510000；2.广州医科大学金域检验学院，广东广州 510000

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年3月至2018年3月广州医科大学附属第一医院雅培全自动免疫分析仪Architect i2000(简称Architect i2000)梅毒检测阳性血清标本96份(1≤S/CO≤10)，健康人标本50份。血清分装后保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.2仪器与试剂 质粒提取和胶回收试剂盒购自天根公司；Premix Ex Taq DNA聚合酶购自TAKARA公司；内切酶XhoⅠ、NcoⅠ、T4 DNA连接酶和蛋白标准相对分子质量购自Thermo Fisher公司；HRP购自Sigma公司；His Trap FF亲和层析柱购自GE公司。

1.3方法

1.3.1重叠PCR基因扩增 根据Genbank中的Tp47基因序列，使用IEDB等预测软件进行B细胞表位预测，选定优势表位基因片段。应用Primer Premier V5.0软件设计引物，委托上海生物工程有限公司合成引物。引物序列见表1。

表1 Tp47基因优势抗原表位的引物设计

使用质粒提取试剂盒提取Tp47基因组DNA，以其为模板，PCR扩增、融合3个基因片段获得多表位融合蛋白基因。反应体系共50.0 μL：2×Ex Taq Master Mix 25.0 μL，引物F1和R3 10.0 μmol/L，其余引物各1.0 μmol/L，模板40.0 ng。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.2构建重组质粒 将PCR产物与pET-28b载体进行双酶切，回收目的DNA片段后于22 ℃下连接3 h，将连接片段转导至感受态细胞DH5α中，经卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒双酶切鉴定并测序。测序阳性质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中准备诱导。

1.3.3重组蛋白的诱导表达与纯化 将重组工程菌按1∶100的比例接种于含卡那霉素的LB培养基中，待菌液A值为0.6～0.8时，加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至水平为1.0 μmol/L。诱导6 h后收集菌液进行超声碎菌(150 W，超声4 s，暂停4 s，共100次)，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后分别收集上清液和沉淀，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。……