郭秉楠，燕宪亮，许 铁

(徐州医科大学卫生应急研究所，徐州医科大学附属医院急救中心，徐州 221004)

巨细胞病毒肺炎其病理表现为弥漫性肺泡损伤、上皮细胞坏死，炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽等，严重者发展为急性呼吸窘迫综合征[1]。同时，作为免疫功能低下人群感染人巨细胞病毒所诱发的最严重的疾病之一，其发病率为50%～70%，死亡率高达25%～31%[2]。因而，探讨其发病机制以便更好地防治显得尤为重要。本文在小鼠模型中研究发现，白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)蛋白促进鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)肺炎的进程可能是通过肺组织中大量骨髓原性的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)活化实现的。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 6～8 周龄Balb/c 小鼠购于徐州医科大学，ST2-/-小鼠由苏州大学肿瘤与分子实验室馈赠，所有小鼠均在无菌条件下饲养，研究符合徐州医科大学实验动物伦理委员会要求；MCMV(Smith 株)由山东医学科学院秦立增教授馈赠；低熔点琼脂糖购于Sigma 公司；RPMI1640 培养基，胎牛血清购自Gibco 公司；实时定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)试剂盒购于Thermo Fisher；IL-33 酶联免疫吸附法(enzymelinked immunoabsorbent assay,ELISA)检测试剂盒，流式抗体Anti-CD11b-APC(M1/70)、Anti-Gr1-PE(RB6-85C)购于Biolegend 公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SDS-PAGE 和Western Blot IL-33 蛋白样品中加入5×Loading buffer，100 ℃煮样10 min；电泳1.5 h后，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，至蛋白条带清晰，拍照保存。SDS-PAGE 电泳后，转印到PVDF 膜上；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜后，等渗盐缓冲液(Tris buffered saline Tween,TBST)漂洗3 次，10 min/次；二抗(1∶5 000)室温孵育2 h 后，TBST 漂洗3 次，10 min/次；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)法检测并拍照分析条带灰度值。

1.2.2 ST2-/-小鼠的鉴定 取待鉴定小鼠尾巴2 mm于EP 管中，加入蛋白酶K 裂解液，55 ℃水浴过夜后，4 ℃，12 000 g，离心5 min，取上清进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定小鼠基因型。引物1：5′-TTGGCTTCTTTTAATAGGCCC-3′；引物2：5′-CTATCAGGACATAGCGTTGGCTACC-3′；引物3：5′-TGTTGAAGCCAAGAGCTTACC-3′；引物1加引物3 能够得到长度约500 bp 的野生型条带；引物2 加引物3 能够得到长度约370 bp 的ST2 敲除条带。

1.2.3 小鼠MCMV 肺炎模型的建立 取6～8 周龄雌性Balb/c 小鼠，鼻腔接种感染5×105空斑形成单位(plaque forming unit,PFU)的MCMV(Smith 株)，连续感染3、7 d 后评价肺部感染情况。

1.2.4 病理学苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色 取小鼠肺组织，固定并石蜡包埋切片，H&E染色，显微镜下观测实验鼠肺组织炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡损伤及局灶坏死情况并评分，血管炎症为1 分；支气管炎症为2 分；肺间质炎性浸润或肺泡间隔增厚为3 分；细胞病毒样病变为4 分。

1.2.5 空斑实验测定MCMV 病毒载量 取MCMV感染小鼠的肺组织100 mg，胶原酶消化，制备单细胞悬液，种于含DMEM 完全培养基的6 孔板中，待细胞长满单层约80%时，弃培养基，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗2 遍，将2.0%低熔点琼脂糖与2×DMEM 以1∶1 混合加到6 孔板中，室温凝固后，37 ℃恒温箱倒置培养4～5 d，待出现蚀斑后，移去琼脂，加细胞染色液覆盖，3～5 min，双蒸水冲洗2 次，计算PFU。

1.2.6 流式细胞术检测MDSC 制备肺单细胞悬液后，流式缓冲液洗2 遍，将Anti-CD11b-APC 和Anti-Gr1-PE 抗体(1∶1 000)与细胞4 ℃避光孵育30 min，流式缓冲液洗2 遍，用流式细胞仪(FACS CantoⅡ)进行检测，Flowjo 软件分析数据。

1.2.7 Real-time PCR 实验 利用RNeasy 试剂盒提取细胞总RNA，Reverse Transcriptase superscript Ⅱ试剂盒合成cDNA，Sybr green Real-time PCR 试剂盒及LC480 Real-time PCR 进行检测相应引物的细胞因子，以β-actin 为内参，引物序列见表1。

1.2.8 ELISA 检测IL-33 96 孔板每孔加100 μL含捕获抗体的包被液4 ℃过夜；含5%曲拉通X-100的磷酸缓冲盐溶液(5% Triton X-100 in phosphate buffered saline,5%PBST)洗4 次；1%牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h；5%PBST 洗4 次；100 μL/孔加入待检测组织匀浆液，37 ℃孵育2 h；5%PBST 洗4 次；100 μL/孔检测抗体，37 ℃孵育1.5 h；5%PBST 洗4次；每孔加100 μL Avidin-HRP，37 ℃孵育0.5 h；5%PBST 洗4 次；显色液显色5～10 min。OD492读数，并根据标准曲线，计算细胞因子的含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件进行统计学分析。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 IL-33蛋白的表达纯化及ST2-/-小鼠的鉴定 首先，构建重组IL-33 基因至原核表达载体pET43.1，在BL-21 宿主菌中诱导表达，纯化目的蛋白(图1A～B)。随后，通过PCR 法验证ST2-/-小鼠(图1C)，ST2 野生型小鼠通过引物扩增得到约500 bp 条带，ST2-/-型小鼠通过引物扩增得到约370 bp 条带。

2.2 小鼠MCMV 肺炎模型的建立 文献[3]报道，小鼠MCMV 肺炎模型可通过鼻腔接种MCMV 病毒建立。5×105PFU 的MCMV(Smith 株)，连续感染3 d、7 d后取小鼠肺组织进行H&E 染色发现可以诱发肺炎的病理表现(图2A)；Real-time PCR 和组织匀浆ELISA 检测IL-33 mRNA 和蛋白水平显示：MCMV处理组肺组织中IL-33 的mRNA 和蛋白水平显著升高(P＜0.05)(图2B～C)。以上结果表明：经MCMV 处理后，成功建立小鼠MCMV 肺炎模型。

2.3 IL-33 蛋白加重小鼠MCMV 肺炎 上述模型进一步尾静脉注射IL-33 蛋白，发现IL-33 蛋白含量在肺组织中显著升高，且在第5 天达到峰值，之后缓慢下降(图3B)；分别在不同时间点取肺组织进行H&E 染色并进行病理评分，发现第7 天小鼠肺炎病理表现最为严重(图3A、C)；不同时间点取小鼠肺组织空斑实验发现IL-33 蛋白处理组中MCMV病毒浸润显著升高(P＜0.05)(图3A、D)；然而，在ST2-/-小鼠中建立MCMV 肺炎模型后，尾静脉注射IL-33蛋白发现：与WT 小鼠比较，感染后第7 天ST2-/-小鼠肺炎病理表现显著降低(P＜0.05)(图3A)，同时其肺组织中的MCMV 病毒含量亦显著降低(P＜0.05)(图3D)。以上结果表明IL-33 可以加重小鼠MCMV肺炎。

2.4 肺MDSC 介导IL-33 蛋白加重小鼠MCMV 肺炎 随后，取野生型及ST2-/-小鼠的肺组织，制备单细胞悬液，通过流式细胞术发现，野生型小鼠肺组织中CD11b+Gr1+MDSC 的表面高表达IL-33 受体ST2(图4A～B)；与对照组比较，野生型小鼠经IL-33 蛋白处理组肺组织中大量浸润CD11b+Gr1+MDSC(P＜0.05)(图4C～D)；ST2-/-小鼠经过IL-33 蛋白处理组肺中MDSC 细胞并无显著增加(图4C～D)。以上结果表明，IL-33 加重小鼠MCMV 肺炎可能是由于IL-33 与MDSC 表面ST2 受体相结合导致MDSC 大量扩增而引起。

2.5 IL-33 促进肺MDSC 发挥免疫抑制功能 首先分选得到MCMV 肺炎模型及对照组小鼠肺组织中的MDSC，通过Real-time PCR 分析与MDSC 生成且发挥免疫抑制作用相关分子发现，IL-33 处理组MDSC 功能相关的Arginase-1、iNOS 的mRNA 表达水平显著升高；Th2 型细胞因子IL-13 而不是IL-4的mRNA 表达水平显著升高；相反的，Th1 型细胞因子IL-12 的mRNA 表达水平显著降低(图5)。

3 讨 论

IL-33 是2005 年J.SCHMITZ 等[4]发现的IL-1 家族的新成员，多表达于上皮细胞、内皮细胞及活化态的免疫细胞上[5]。IL-33 作为一种新型损伤相关分子模式/警报素(damage associated molecular patterns,DAMPs/Alarmins)，在炎性刺激、细胞坏死及机械损伤等条件下分泌到胞外发挥生物学功能[6-7]，可促进Th2细胞分化，分泌Th2 型细胞因子(IL-5、IL-10、IL-13)。在哮喘时，当患者暴露于过敏原时，肥大细胞活化并分泌成熟的IL-33，高效激活Ⅱ型固有淋巴细胞(group-2 innate lymphoid cells,ILC2s)，释放大量Th2 型细胞因子，同时也抑制了Th1 型细胞因子的分泌[8]。IL-33/ST2 通路的激活对博来霉素诱导的纤维化肺损伤的形成有着重要的促进作用[9]。本研究发现IL-33 可以促进MCMV 肺炎的发展，可能是由于IL-33 调控肺中MDSC 的活化，活化的MDSC发挥免疫抑制功能而实现的。

在肺部感染过程中，炎症因子的释放和DAMPs/Alarmins 可以诱发宿主损伤甚至死亡[10]。其中，炎症因子和DAMP/Alarmins 可以诱导骨髓生成大量MDSC，MDSC 在趋化因子的作用下向感染部位迁移，并被驯化、激活，表现出自身吞噬能力下降、加速自身凋亡，抑制T 细胞免疫应答的能力[11]。IL-33 作为一种新型的“Alarmin”在炎症过程中可以迅速释放到胞外警示免疫系统组织损伤，活化免疫系统发挥作用。在野生型小鼠MCMV 肺炎模型中，外源加入IL-33 蛋白后，肺炎症状更加严重，且肺组织中IL-33 含量显著升高，并伴随肺组织MDSCs 浸润显著升高。然而，在ST2-/-小鼠中，外源加入IL-33 蛋白后，虽然肺组织中IL-33 含量与野生型小鼠比较差异无统计学意义，但其肺炎的病理学症状较野生型小鼠显著降低，并且肺组织中MDSC浸润亦显著低于野生型小鼠组。以上结果提示，IL-33 促进MCMV肺炎可能是由于与MDSC 表面的ST2 受体相结合活化了MDSC，而活化的MDSC 在肺组织中大量浸润发挥免疫抑制功能从而加重了肺炎的症状。

MDSC 是一群异质性的、不成熟的髓系细胞[12]，在肿瘤、炎症以及自身免疫性疾病中发挥重要的免疫抑制作用[13-15]。MDSC 抑制免疫应答的主要机制有[16]：(1)产生Arginase-1，iNOS 等，抑制T 细胞增殖。(2)产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及一氧化氮，抑制T 细胞信号传导。(3)产生免疫抑制分子IL-10，转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制自然杀伤(natural killer,NK)细胞及巨噬细胞的功能。(4)促进调节性T 细胞的发育，间接抑制免疫应答。本研究对MCMV 肺炎小鼠注射外源IL-33 蛋白，分选肺中MDSC 后，通过Realtime PCR 发现Arginase-1 和iNOS 免疫抑制性分子与对照组相比显著上调，显示IL-33 活化的肺MDSC 具有显著的免疫抑制作用。同时，IL-13 作为一种Th2 型细胞因子，也可能破坏肺上皮细胞的完整性等多种机制参与肺气道炎症及肺高敏反应[17]。本研究发现，MCMV 肺炎模型组中，IL-33 加剧了肺MDSC 高表达IL-13，亦对IL-33 通过活化MDSC 促进巨细胞病毒肺炎提供了证据。

虽然本研究能够证实IL-33 促进MCMV 肺炎是通过活化MDSC 实现的，亦发现了MDSC 发挥免疫抑制功能的相关分子的显著升高，但是MDSC 是否能够促进肺中调节性T 细胞，对肺中的T 细胞是否有直接的抑制作用等机制还有待进一步探索。本研究拓展了MCMV 肺炎的发病机制，为临床防治MCMV 肺炎提供了理论基础。