李曼，齐大明，王鑫源，李询，邢冰，杨朝帆，董诚明

河南中医药大学，河南郑州450046

牛膝（Achyranthes bidentata B1.）为苋科牛膝属多年生草本植物，以干燥根入药，为常用大宗药材品种之一，主产于河南温县、河南武陟、内蒙古赤峰、河北安国等地，有较高的药用价值和经济价值，繁殖方式主要是种子繁殖，种子分为秋子和蔓薹子。现有研究表明，不同产地牛膝在化学成分含量方面存在差异［1-4］。近年来，对于牛膝的研究也多集中在化学、药理等方面［5-9］，关于分子标记研究牛膝遗传多样性及遗传结构的报道较少［10-11］。与其他分子标记技术相比，简单序列重复区间扩增多态性分子标记（intersimple sequence repeat，ISSR）具有稳定、多态性高、简便及易操作等优点，被视为理想的遗传标记方法［12］。目前ISSR已在多种动植物的亲缘关系、种质鉴定等研究方面得到应用［13］。本研究应用ISSR分子标记法，分析不同产地牛膝的遗传多样性及亲缘关系，对牛膝规范化种植及资源开发等方面提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验药材采集内蒙古、河北、河南等地的牛膝种子；牛膝经河南中医药大学董诚明教授鉴定为苋科植物牛膝（Achyranthes bidentata B1.）。采集信息见表1。

表1 采集信息表

1.2 实验仪器NanoDropTMOne超微量紫外分光光度计（美国赛默飞公司）；超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；C1000 TouchTM梯度PCR仪（美国伯乐公司）；JW-2018H冷冻高速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；DYCP-31E型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）；GelDoc XR+凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）；LDZM-80KMS型立式蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BCD-215KS型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；迷你掌上离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；微量移液枪（德国艾本德有限公司）。

1.3 实验试剂DNA提取试剂盒（批号:CW0531M）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、Gold View I型核酸染色剂、DM2000、DM15000、2×Es Taq MasterMix（Dye）等（康为世纪生物科技有限公司）；琼脂糖、Tris［三（羟甲基）氨基甲烷］（北京索来宝科技有限公司）；10×Lodding Buffer［宝生物工程（大连）有限公司］。

2 实验方法

2.1 DNA的提取及检测取保存的牛膝样品，采用植物试剂盒方法提取基因组DNA。将所得的DNA溶液分别装入灭菌后离心管中，于 -20℃保存。将保存的DNA用质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压130V，电泳40min。在GelDoc XR+凝胶成像仪上成像，保存DNA检测结果。

2.2 PCR引物的筛选、ISSR-PCR扩增及检测

参考牛膝、川牛膝以及苋科植物等［10，14-15］研究文献中出现的引物，以及加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR引物序列，随机选取2个牛膝样品模板DNA，采用最优ISSR-PCR体系中的扩增条件，从ISSR引物中筛选出16条反应体系较稳定、扩增条带较清晰且多态性较多的引物，最优引物序列见表2。PCR反应体系总体积为20μL，含有DNA样品1μL，引物1μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）10μL，加ddH2O至体积20μL。反应程序:94℃预变形5 min，95℃变性1 min，52～57℃退火1 min，72℃总延伸5 min，共35个循环，4℃保存。PCR产物质量分数2%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液中电泳40 min，电压为130V。Marker为2 000 bp。电泳后，在GelDoc XR+凝胶成像仪上拍照并保存DNA检测结果。

2.3 数据分析根据样品ISSR扩增谱带信息，按照邹喻萍等［16］制定的标准，以扩增条带有计为“1”，无计为“0”。用Quantity One软件对图谱上的条带进行人工标记，并导出为0-1矩阵的数据。采用POPGENE3.2软件计算出遗传特征值:有效等位基因数（ne）、观测等位基因数（na）、多态性位点比例（P）、香农信息指数（I）、遗传分化系数（Gst）、基因流（Nm）等，进行遗传多样性分析。用NTSYS2.10软件对不同产地牛膝进行个体间的UPGMA聚类分析。

表2 最优引物序表

3 结果

3.1 SSR-PCR扩增结果用筛选出的16条引物对6个采集地的39个样品进行扩增，共扩增出251条条带，在多态性条带中其有效条带数为233条，有效条带数占总条带数的92.83%。16条引物扩增出的条带数为8～23条，引物UBC-889扩增出的条带最多为23条；16条引物在所有样品中所扩增出的引物有效条带数为8～21条；引物在不同产地牛膝中扩增出来的有效条带数为0～16条；不同产地牛膝共扩增出196条多态性条带。PCR扩增结果见表3，引物UBC-834对牛膝的PCR扩增结果见图1。

3.2 牛膝遗传多样性分析对不同产地牛膝进行遗传多样性统计分析，结果见表4。由多态性位点可知，牛膝的遗传变异情况由低到高为HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，变化范围为19.92%～45.02%；由等位基因数（na）可知，牛膝的遗传变异情况由低到高为HJWXM ＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HNAG＜HJWZM，变化范围为1.199 2～1.450 2；由有效等位基因数（ne）可知，牛膝的变异情况由低到高依次为HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，变化范围为1.159 0～1.268 5；由Nei′s基因多样性指数（h）得出，牛膝的变异情况由低到高依次为HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM＜HNAG，变化范围为0.088 5～0.159 0；依据香农信息指数（I），牛膝的变异情况由低到高依次为HJWXM＜HJWZQ＜NMGCF＜HJWXQ＜HJWZM ＜HNAG，变化范围为0.126 8～0.237 8。

表3 不同采集地ISSR引物扩增条带结果

图1 引物UBC-834对牛膝的PCR扩增结果图

对不同产地牛膝的遗传多样性进行分析评价可知，香农信息指数（I）、Nei′s基因多样性指数（h）、有效等位基因数（ne）、多态性位点和等位基因数（na）对牛膝的变异情况基本一致。

表4 牛膝的遗传变异分析结果（±s）

表4 牛膝的遗传变异分析结果（±s）

类型 样本数 多态性位点（P）/个（%）等位基因数（na）有效等位基因数（ne） Nei′s基因多样性指数（h） 香农信息指数（I ）0.237 8±0.282 1 NMCF 7 93（37.05）1.370 5±0.483 9 1.222 1±0.330 4 0.132 7±0.184 3 0.199 4±0.269 9 HJWZQ 7 87（34.66）1.346 6±0.476 8 1.221 9±0.345 3 0.129 1±0.188 5 0.192 0±0.273 4 HJWZM 9 111（45.02）1.450 2±0.498 5 1.256 4±0.338 1 0.1544±0.1877 0.233 9±0.273 8 HJWXQ 6 95（37.85）1.378 5±0.486 0 1.240 1±0.348 0 0.141 0±0.190 8 0.210 1±0.277 8 HJWXM 3 50（19.92）1.199 2±0.400 2 1.159 4±0.320 2 0.088 5±0.177 9 0.126 8±0.254 7总共39 196（78.09）1.780 9±0.414 5 1.350 9±0.333 3 0.217 0±0.177 1 HBAG 7 109（43.43）1.434 3±0.496 7 1.268 5±0.350 3 0.159 0±0.193 8 0.337 6±0.248 1

3.3 遗传结构分析对不同产地牛膝的遗传结构分析可知，牛膝的总遗传多样性指数（Ht）为0.223 7±0.033 7，种内遗传多样性指数（Hs）为0.134 1±0.013 9，基因分化系数（Gst）为0.400 3，不同种群间的基因流（Nm）为0.749 2，多态性位点的比例（P）为196（78.09%），香农信息指数（I）为0.337 6±0.248 1。牛膝种群间的遗传变异为40.03%，表明不同产地牛膝基因交流程度较高，遗传分化较小。

3.4 遗传距离与遗传一致度对不同产地牛膝进行遗传距离与遗传一致度分析，结果见表5。不同产地牛膝之间遗传一致度为0.789 1～0.950 6、遗传距离为0.050 7～0.236 9，表明不同产地牛膝间的亲缘关系较近，不同繁殖类型牛膝亲缘关系也相近。

表5 牛膝的遗传距离与遗传一致度

3.5 聚类结果分析

3.5.1 产地聚类分析对不同产地牛膝的遗传一致度进行聚类分析，聚类结果见图2。系统聚类时其遗传一致度为0.79～0.95。由相似系数0.87处可将牛膝分为2类，第Ⅰ类为HBAG、NMGCF、HJWZQ、HJWZM，第Ⅱ类为HJWXQ和HJWXM。第Ⅰ类继续细分，又可分为2个亚类，HBAG 和NMGCF为一个亚类，HJWZQ和HJWZM 为另一个亚类。由聚类分析可知，河北安国、内蒙古赤峰、河南武陟、河南温县间的亲缘关系较近，秋子与蔓薹子亲缘也较近。

3.5.2 个体间聚类分析使用Ntsys2.1软件对6个采集地的39个样品基于遗传相似性系数进行UPGMA聚类，聚类结果见图3。聚类结果显示，从相似系数0.75处划分，39个样品共聚为2类，样品1-32聚为一类，表明内蒙古赤峰、河北安国与河南武陟牛膝的亲缘关系较近；样品33-39聚为一类，相同产地的牛膝基本聚为一类，也有少数同一产地的牛膝样品没有聚在一类，如样品13、14交错于样品1-7之间，表明内蒙古赤峰与河北安国的亲缘关系较近；样品22、24交错于样品12-21之间，说明河南武陟秋子和蔓薹子的亲缘关系较近；样品31-36为河南温县的秋子和蔓薹子，其样品相互交错着，表明河南温县秋子和蔓薹子的亲缘关系一致。结合产地聚类和个体聚类结果可知，内蒙古赤峰、河北安国、河南武陟、河南温县牛膝亲缘关系较近，秋子与蔓薹子亲缘较近。

图2 牛膝遗传聚类UPGMA聚类图

图3 个体间遗传聚类的UPGMA聚类图

4 讨论

本研究利用ISSR方法对不同产地牛膝进行遗传多样性分析。由遗传多样性分析可知，不同产地牛膝基因交流程度较高，遗传分化较小，孔德政等［17］对河南省内8个野生牛膝种群进行遗传多样性分析，结果显示河南省内的野生牛膝种群间的遗传分化较低，种群间的基因交流较高，遗传多样性相对较低，与实验结果相一致。由遗传距离进行亲缘关系分析，不同产地牛膝之间遗传一致度为0.789 1～0.950 6、遗传距离为0.050 7～0.236 9，表明不同产地牛膝间的亲缘关系较近；根据聚类结果分析可知，不同产地的牛膝遗传结构不严格按地理距离划分，表明不同产地牛膝有较大的基因交流程度，在对产地聚类和个体聚类时发现，两者结果相似，河北安国、内蒙古赤峰和河南武陟亲缘较近，河北安国和内蒙古赤峰为近年来新兴的牛膝主产区，由河南焦作道地产区引种栽培，虽已种植多年，但遗传变异较小。秋子与蔓薹子因种子的繁殖方式不同对牛膝的生殖、产量等造成差异，但其遗传物质一致，由此遗传多样性较小，亲缘关系相近。

ISSR分子标记在亲缘关系鉴定、遗传关系、种质鉴定等方面应用较为广泛。杨正久等［18］采用ISSR分子标记，对21份贵州金钱草资源进行聚类分析，分为2大类群6个亚群，贵州野生金钱草具有丰富的遗传多样性。巨秀婷等［19］采用ISSR分子标记对5个新疆野生郁金香品种和19个郁金香栽培品种进行遗传多样性分析，结果表明野生品种与栽培品种之间遗传距离较远，且大部分栽培品种之间亲缘关系较近，为合理利用野生郁金香种质资源提供分子水平的研究基础。因此，未来可通过分子标记方法对牛膝亲缘关系鉴定，结合不同产地牛膝的质量评价，为牛膝规范化种植及资源开发等提供科学依据。