赵书雪，刘苗苗，吉建成，卢思雨，徐丽丽**

（1.青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室，山东 青岛 266109；2.青岛市农产品质量安全中心，山东 青岛 266109）

侧耳属（Pleurotus） 食用菌隶属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目（Agaricales） 侧耳科 （Pleurotaceae）[1]。据报道，我国目前有36种侧耳属真菌，均有较高的蛋白含量、丰富的氨基酸组成[2]，具有较高的营养价值。侧耳因其栽培方法简便，投资小，见效快，效益高等优点而被广泛栽培[3]。

随着食用菌驯化栽培技术的不断发展，人们对野生食用菌资源的开发和利用有了新的认识，侧耳属多糖、蛋白具有增强免疫力，抗癌等功效[4]。通过对野生侧耳进行驯化栽培研究，不断探索野生菌株生长的环境条件，制定出适合野生菌株栽培的方案；不断优化野生驯化菌株栽培条件，改变其部分特性，逐渐成为适合本地栽培的人工栽培品种；并测定其子实体的营养成分，筛选出最适栽培方法，指导生产实践。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

侧耳属菌株5271，由云南农科院苏开美老师于昆明境内采集并赠送；侧耳属菌株1710，采自山东潍坊境内的野生菌株经组织分离纯化得到。

1.1.2 供试培养基配方及制备

棉籽壳45%、木屑30%、玉米粉30%、麸皮10%、石膏3%，磷酸二氢钾0.5%、尿素0.5%，糖1%[5]。栽培种培养基制备料水比为 1∶1～1∶1.8，配制30 kg栽培料，每袋装约750 g，121℃灭菌2 h。

1.2 主要仪器

日立8900高速氨基酸分析仪：沈阳奇特尔科技有限公司；XSP-9CA显微镜：上海光学仪器一厂；MR23i离心机：法国捷安公司；DRP-9082恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；spctro art200分光光度计：美国威泰克公司；EP214C电子天平：奥豪斯国际贸易有限公司（上海）等。

1.3 菌种鉴定方法

1.3.1 菌丝性状观察

野生菌株采用组织分离法接种于PDA固体培养基上，将灭过菌的载玻片斜插到离菌块2 cm处，置26℃恒温培养箱中暗光连续培养[6]。待菌丝长至载玻片上，取载玻片于显微镜下观察其菌丝结构及有无锁状联合。

1.3.2 菌丝体DNA提取及ITS验证

采用Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒提取DNA，采用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 进行PCR扩增[7]，得到的PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.4 侧耳菌株5271、1710菌丝最适生长条件及栽培条件的优化

1.4.1 菌丝最适生长温度

取直径为5 mm的菌株菌饼接种于PDA固体培养基中央，分别于18℃、22℃、26℃、30℃、34℃恒温培养箱避光倒置培养，每组设置3个重复，连续培养5 d。釆用十字交叉法每天定时测量菌落直径，计算不同温度培养条件下菌丝生长速率，菌丝生长速率（V，mm·d-1）计算公式为：

式中：Φ为菌落平均直径（mm），d为菌丝生长天数（d）。

1.4.2 菌丝最适生长pH

将 pH 设置为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，共 5 个梯度，每组设置3个重复，分别倒置于最适温度恒温培养箱避光培养，测定及接种方法同1.4.1。

1.4.3 子实体最适栽培培养基筛选

按照 1.1.2栽培培养基配方，分别培养菌株5271、1710，观察其子实体栽培性状（主要是结实性），并进行子实体出菇试验，探索是否可以应用于实践，指导实际生产。

1.5 子实体营养成分分析

1.5.1 子实体含水量测定

将新鲜子实体称重后放入烘箱中，40℃～60℃烘干4 h～5 h，再升温至60℃～70℃，烘干直至恒重，记录数据。

1.5.2 子实体中氨基酸含量分析

利用日立8900高速氨基酸分析仪，参考GB 5009.124-2016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定测定子实体中氨基酸的含量。

1.5.3 子实体中粗多糖含量测定

按照水提醇沉法[8]提取子实体多糖；按苯酚-硫酸法[9]测定多糖含量，按照NYT 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定标准绘制葡萄糖标准曲线，后根据标准曲线计算多糖含量。粗多糖提取液中的多糖提取率（T，%）的计算公式为：

式中：C为测定浓度（mg·mL-1）；D为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；ω为称取子实体粉末质量（g）；0.9 为还原糖换算成多糖的系数[9]。

1.5.4 子实体中粗蛋白含量测定

子实体粗蛋白含量测定采用蛋白定量测试盒[10]测定，计算子实体中粗蛋白含量。

1.5.5 子实体中其他常规营养成分含量测定

参考GB 5009.90-2016食品中铁的测定测定子实体铁含量；GB 5009.92-2016食品中钙的测定测定子实体中钙的含量；GB 5009.86-2016食品中抗坏血酸的测定测定子实体VC含量；GB 1886.233-2016食品添加剂维生素E测定子实体VE含量。

2 结果与分析

2.1 野生菌株菌丝培养观察及ITS鉴定

2.1.1 菌丝生长形态

将野生菌株5271、1710菌饼转接至PDA培养基培养5 d后，菌丝生长情况如图1、图2所示。

由图1、图2可知，野生菌株5271气生菌丝生长较发达，呈绒毛状，菌丝尖端较为粗壮，颜色较白，边缘生长整齐。野生菌株1710菌落呈绒毛状，圆形，菌丝洁白，菌落正反颜色无差异，菌落边缘较整齐，浓密。

2.1.2 野生菌株ITS鉴定

2株野生菌株ITS序列扩增电泳图见图3。

由图3可知，野生菌株5271、1710通过ITS1和ITS4引物扩增后的碱基数约为700 bp。通过测序比对发现，菌株5271与肺形侧耳Pleurotus pulmonarius有99%的相似性，菌株1710与紫孢侧耳Pleurotus sapidus有99%的相似性。

2.2 培养条件筛选结果

2.2.1 温度对2株菌丝生长的影响

菌株在不同温度梯度培养5 d，各菌株菌丝生长情况见图4，菌丝生长速率见图5。

由图5可知，菌株5271在26℃时，菌丝生长速率最快，菌丝稠密、洁白，菌丝边缘生长整齐，在其他温度时菌丝生长速率较慢。菌株1710在30℃时，菌丝生长速率最快，菌丝洁白、稠密，菌丝边缘生长整齐，在34℃时，2菌株菌丝仍可生长，菌株1710菌丝生长速率比5271快，耐受温度高。综上所述，在试验温度梯度中，最适5271菌丝生长温度为26℃，1710菌丝生长最适温度为30℃。

2.2.2 pH 对 2 株菌丝生长的影响

2株菌株在不同培养基pH且置于最适生长温度下培养5 d，菌丝生长情况见图6，菌丝平均生长速率统计见图7。

由图6、图7可知，2株菌株在pH为7条件下长势均较好，在pH5～9均能生长；菌株5271菌丝边缘整齐、菌丝较白；菌株1710菌丝洁白、边缘整齐、稠密。可见pH对菌丝生长速率影响较小，菌株1710菌丝长势优于5271生长情况。综上，2株菌株生长的最适pH为7。

2.3 2株野生菌株出菇试验结果

2.3.1 野生菌株栽培培养基筛选结果

对结实性的考察主要是考察原基形成所需时间。菌株5271原基形成时间20 d，1710原基形成时间17 d，2株菌株从原基形成到采收第一茬需要约5 d。子实体出菇条件为温度15℃～17℃、湿度85%，光照强度为600 lx[11]，2株菌菌丝在菌包中生长速度较快、形成原基时间短、出菇期间转潮快、出菇持续时间长，此时菌株5271、1710生物学效率分别达 100.03%、105.97%。

2.3.2 菌株子实体特征

2株野生菌株人工培养出菇结果见8。

如图8A所示，菌株5271菌盖形状呈扁半球形至平展，倒卵形至肾形或近扇形，大小5 cm～13 cm，颜色为白色、灰白色至灰黄色，表面光滑，菌肉白色，靠近基部稍厚；菌褶白色，延生，稍密，不等长；菌柄很短或没有，白色有绒毛，后期近光滑，内部实心至松软。从图8B看出菌株1710子实体菌盖呈黑褐色，与菌株5271颜色完全不同，呈半球形，靠近基部稍厚，菌褶白色，延生；菌柄较长。

2.3.3 菌株孢子印及孢子形态观察

菌株5271野生菌株孢子印及孢子形状见图9，菌株1710野生菌株孢子印及孢子形状见图10。

由图9、图10所示，菌株5271孢子印呈扁半球形，白色；孢子浅绿色，呈近梭形。菌株1710孢子印呈近圆形，颜色为白色；孢子淡黄色，呈近梭形。

2.4 子实体营养成分分析结果

2株子实体中营养成分含量见表1。

表1 2株子实体中营养成分含量Tab.1 Content of nutrients in two fruiting bodies

由表1可知，2株菌株营养成分含量存在差异，其中，菌株5271、1710子实体中粗多糖含量分别含有 12.47 g·100-1g-1、19.42 g·100-1g-1，均比文献[12-13]报道高；菌株5271、1710子实体中粗蛋白质含量分别为 13.14 g·100-1g-1、15.40 g·100-1g-1。测定的微量元素Fe、Ca含量均较高，菌株1710子实体中 Fe含量高达 173.78 mg·100-1g-1。菌株 1710子实体中VE含量高于5271子实体中的含量，两者相差2.28倍。而菌株5271子实体中VC含量是1710的4.55倍。根据综合分析，1710菌株有更高的营养价值。

2.5 菌株氨基酸含量分析结果

采用日立L8900型氨基酸自动分析仪测得了2株侧耳属菌株中17种氨基含量，包括赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸8种必需氨基酸（EAA），天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸9种非必需氨基酸（NEAA）[14]，由于采用酸水解法使得色氨酸结构不稳定，试验未测。与已报道的糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus） 子实体氨基酸含量为对比[15]，2株野生侧耳与糙皮侧耳中氨基酸含量见表2。

由表2可知，2株菌株中17种氨基酸含量均不同，其中，2株菌株中酪氨酸、苯丙氨酸含量相差较大，约1.3倍左右。与糙皮侧耳子实体苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸等含量相差不大（胱氨酸未检测），缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、蛋氨酸含量相差较大。菌株5271子实体中氨基酸总量、EAA、NEAA氨基酸含量均高于1710子实体，与糙皮侧耳相差不大。

表2 2株野生侧耳与糙皮侧耳中氨基酸含量比较Tab.2 Comparison of amino acid contents between two wild Pleurotus spp.pellucidum

3 讨论

对野生菌种质资源的采集和鉴定是食用菌产业发展的一项基础性研究工作[15]，通过驯化筛选可得到更多的工厂化栽培菌种。目前对野外采集真菌主要通过形态、ITS等进行鉴定。通过对采集的野生菌种鉴定可知菌株5271为肺形侧耳，1710菌株为侧耳属紫孢侧耳。研究了菌株5271、1710菌丝生长的最适条件；通过栽培条件筛选试验发现该2株菌株都具有优良的栽培性状。2株菌株子实体中粗蛋白、粗多糖、微量元素、VC、VE及氨基酸含量进行测定，综合分析，发现1710子实体营养价值更高。试验对野生侧耳属真菌的驯化栽培研究可为今后侧耳属真菌野生资源开发利用，新种质资源的获取及遗传育种等提供理论依据。