武国平，马光跃，陈红玉，杨俊强，申仲妹

（山西农业大学园艺学院，山西太原030031）

枣树是原产于我国的特有果树，不仅是干、鲜兼用果树树种，更是重要的生态经济和药用植物树种。山西省是枣树资源大省，栽培历史悠久，全省93 个区、县均有枣树分布，品种资源丰富，地方品种达100 多个[1]，但主栽品种仅有10 多个，特别是产区品种存在单一、有同质化的趋势，给枣树种质资源的保存、改良及育种带来极大不利，危害着山西枣树产业的发展[2-3]。因此，利用分子生物学手段，从分子水平研究山西主要栽培枣树品种（系）的遗传多样性及相对亲缘关系非常必要，为栽培枣种质创新及品种选育提供理论依据。

目前，国内学者先后采用 RAPD[4-6]、SSR[7]、ISSR[8-9]和AFLP[10-11]技术在枣树品种（系）的遗传关系方面进行研究，初步报道了枣树群体的遗传多样性，但是关于山西主要栽培枣树品种亲缘关系的分析鲜有报道。SSR 标记具有多态性强、重复性好、操作简单和共显性遗传等优点，覆盖整个基因组[12]，被广泛应用于作物种质资源遗传多样性及亲缘关系研究。

本研究利用20 对多态性高的SSR 引物分析了37 个山西主要栽培枣品种（系）的亲缘关系，旨在明确其间的遗传差异及亲缘关系，以期为山西主要栽培枣树品种（系）鉴定和育种改良提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试的37 个枣树品种（系）（表1），分别于2018 年9 月9 日至9 月13 日在山西省临猗县、稷山县、万荣县、永和县、柳林县及山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃采集。采集供试品种新梢顶部嫩叶，随即放入盛有干燥硅胶的自封塑料袋中，置于车载冰箱中，当晚保存于-30 ℃冰箱待用。

表1 供试品种来源及编号

1.2 试验方法

1.2.1 枣基因组DNA 的提取与检测 利用液氮将叶片样进行充分研磨后，使用TIANGEN 公司的植物基因组DNA 提取试剂盒对枣叶片样进行DNA的提取。枣样品DNA 提取结束后，检测其浓度及质量：一是利用核酸蛋白检测仪对枣DNA 浓度进行检测，测定其 A260、A280、A230、A260/A280和 A260/A230的数值；二是通过1%的琼脂糖凝胶电泳，测定枣树样品DNA 的质量。

1.2.2 枣SSR 引物筛选 通过阅读相关文献，并自行设计EST-SSR 引物，从中筛选出多态性较高、重复性好的枣SSR 引物，获取其引物序列，并由上海生物工程技术有限公司合成。先选取枣8 个样品DNA 为材料（编号 1、2、3、5、8、10、12），对所有合成的50 对枣SSR 引物进行PCR 扩增筛选，PCR 扩增体系是在10 μL 反应混合物中进行，其中包括1 μL 10×buffer 缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，0.4 mmol/L 引物，10 U/μL Taq-DNA 聚合酶，1 μL 模板 DNA，加入双蒸馏水6.7 μL，最终获得10 μL 体积的混合物。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性40 s，53～58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 40 s，扩增循环35 次后72 ℃延长8 min。然后，在4 ℃下对样本进行维护。得到PCR 扩增产物后，在1.5%的琼脂糖凝胶电泳下进行电泳检测。

1.2.3 毛细管电泳试验 对所选的样品进行SSRPCR 扩增，扩增产物用Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳仪进行检测。

1.3 数据统计分析

原始数据经Flexibin 程序修正后转化成0，1 格式，建立原始矩阵[13]。SSR 引物位点多态性信息量PIC（Polymorphism information content）按公式（1）计算。

式中，PIC 表示位点 i 的 PIC 值，Pij表示位点 i的第j 个等位位点出现的频率。

材料之间遗传相似系数（Genetic similarity，GS）按NEI 等[14]的方法计算。采用POPGENE 1.32 软件对各遗传多样性参数进行评估，并用UPGMA 方法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 DNA 的提取及电泳检测结果

对1、2 号等11 个样品所提取的枣基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行检测（图1），DNA 条带清晰、明亮，说明DNA 完整性较好，对不符合要求的样品进行第2 次重提。提取后利用核酸蛋白检测仪对提取的DNA 纯度进行检测，结果显示，100%的枣DNA 的 A260/A280值在 1.7～2.0，DNA 纯度较好。

2.2 SSR 引物筛选结果

选取枣 8 个样品 DNA 为材料（编号 1、2、3、5、8、10、12），对所合成的 50 对枣 SSR 引物进行筛选，引物筛选部分结果如图2 所示。经过PCR 扩增，最优选出20 对扩增条带清晰、稳定性好、多态性丰富的引物（表2）用于后续试验。

表2 20 对枣SSR 引物信息

2.3 SSR 标记的多态性分析

利用20 对SSR 引物对37 个枣树品种（系）进行遗传多样性分析。结果显示（表3），检测到375 个等位基因变异，平均每个位点检测到等位变异数为18.75 个，变化范围为11～31 个，位点多态性信息含量PIC 变化范围为0.719～0.967，平均为0.913。以上数据表明，取自山西的37 个栽培枣树品种（系）遗传多样性丰富。

2.4 供试枣树的UPGMA 聚类分析

37 个栽培枣树品种（系）的遗传相似系数（GS）变幅为 0.795～0.917，平均 GS 值为 0.852。10 号（普通赞皇）和38 号（北京白枣）的GS 值最小，均为0.795，19 号（晋园晚红）和 21 号（晋抗裂 4 号）的GS 值最大，均为 0.917。

以37 个栽培枣树品种（系）的遗传相似度为基础，利用NTsys2.0 软件，采用UPG2.4 聚类结果MA方法对其进行聚类，结果显示（图3），供试品种（系）在0.82～0.95 范围内聚类，在0.83 处分为两大类，其中，第Ⅰ类在相似系数0.86 处又可分成9 个亚类，第Ⅰ亚类含有15 个品种，分别为1 号（抗裂条枣）、7 号（蒲城晋枣）、8 号（保德油枣）、2 号（晋抗裂 5 号）、6 号（中阳木枣）、15 号（临黄 1 号）、19 号（晋园晚红）、26 号（永和普通条枣）、21 号（晋抗裂4 号）、27 号（晋园红枣疯病）、29 号（永和大条枣）、28 号（晋园红）、10 号（赞皇大枣）、12 号（相枣）、30 号（晋抗裂3 号），第Ⅱ亚类含有45 号（婆婆枣）1 个品种，第Ⅲ亚类含有3 个品种，分别为16 号（佳县脆木枣）、18 号（屯屯枣）、22 号（柳林木枣），第Ⅳ亚类含有3 个品种，分别为3 号（抗裂赞皇）、9 号（鸡心酸枣）、5 号（板枣（大果）），第 V 亚类含有4 号（抗裂板枣）和 11 号（狗头枣）2 个品种，第 VI亚类含有 13 号（稷山板枣）、14 号（俊枣）2 个品种，第 VII 亚类含有 31 号（蟠桃枣）1 个品种，第 VIII 亚类含有 32 号（冬枣）、46 号（晋冬枣）2 个品种，第VIIII 亚类含有35 号（团枣）1 个品种；第Ⅱ类含有7 个品种，分别为 33 号（宫枣）、38 号（北京白枣）、34 号（芒果冬枣）、37 号（冷白玉）、39 号（骏枣）、40 号（壶瓶枣）、36 号（官滩枣）。

表3 20 对SSR 引物等位变异数和PIC 值

3 结论与讨论

SSR 标记在研究不同材料亲缘关系、遗传多样性及其种质资源保护上具有很大的潜力，在枣树及其他作物育种中已得到广泛应用，并得到可靠的研究成果[15-18]。麻利颖等[19]利用12 对SSR 引物对36个枣品种进行分析，PIC 值变幅为0.62～0.85，平均为0.75。喇菲菲等[20]利用11 对SSR 引物对84 个枣品种进行遗传多样性分析，共检测到37 个多态性位点，PIC 值变幅为0.19～0.67，平均为0.48。刘秀云等[21]利用从64 对SSR 引物中筛选出23 对高效率SSR 引物，在供试材料中共检测出117 个多态性位点，PIC 值变幅为0.359～0.727，平均为0.548。通过比较位点多态性信息含量PIC 值指标，可以提出更加适宜栽培枣品种（系）SSR 分析的引物，对其遗传多样性分析提供理论依据，对于经济有效和快速进行枣树的分子生物学分析具有一定的指导意义[22]。本研究结果显示，20 对SSR 引物所揭示的37 个山西主要栽培枣树品种（系）等位变异数变化范围为11～31 个，平均为18.75 个，位点多态性信息含量PIC 变化范围为0.719～0.967，平均为0.913。表明，本研究从50 对SSR 标记中筛选到的20 对SSR 标记适宜于对栽培枣树品种（系）的遗传多样性分析，能对学者们开展相关研究给予一定的参考。

本试验利用SSR 分子标记对山西主要枣树栽培品种的亲缘关系进行了研究，37 个枣树品种（系）的遗传相似系数（GS）变幅为0.795～0.917，平均GS 值为0.852，在相似系数0.83 处可将供试品种（系）聚为2 大类，第Ⅰ类在相似系数0.86 处又可分为9 个亚类。说明山西主要枣树栽培品种存在地区同质化现象，这也反映了在枣树育种中的突出问题，一方面需要根据育种目标充分选择利用种质资源，选用遗传距离比较远的亲本进行杂交；另一方面应注重将繁多的枣树品种进行引种收集，分类鉴定，注重枣树资源保护。