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薄层色谱法检测大豆皂苷的条件优化

2021-01-18范姝姝徐海军杜维俊赵晋忠岳爱琴

山西农业科学 2021年1期
关键词:皂苷大豆温度

范姝姝 ,徐海军 ,杜维俊 ,赵晋忠 ,岳爱琴

(1.山西农业大学农学院,山西太谷030801;2.山西农业大学基础部,山西太谷030801)

大豆皂苷是大豆中重要的次生代谢产物之一,具有多种对人体有益的生物活性,如抗癌[1-2]、抗病毒[3]、抗血脂[4],对人结肠癌细胞的抗增殖作用[5-6],以及通过分泌甲状腺激素减少肝脏脂质过氧化[7]。其主要分布在大豆种子中,含量为0.6%~6.2%[8]。大豆皂苷属于五环三萜类齐墩果酸型,由非极性的三萜苷元大豆皂醇A、皂醇B 和β-D- 葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D- 木糖、β-D- 葡萄糖醛酸、α-L- 鼠李糖、α-L- 阿拉伯糖6 种糖基及其乙酰化糖基等组成[9-10]。根据苷元不同可将大豆皂苷分为A 类、B 类、DDMP 类、E 类[11-12]。A 类皂苷是大豆皂醇 A 的 C-3和C-22 位上结合了2 个糖基链。目前,A 类皂苷根据 C-22 糖苷的不同分为 3 个系列:Aa 系列(Aa、Au、Ae、Ax、Ay、Ag)、Ab 系列(Ab、Ac、Af、Ad、Az、Ah)和 A0 系列(A0-αg、A0-βg、A0-γg、A0-αa、A0-βa、A0- γa)[13-15]。

目前,对大豆皂苷定性分析的方法有薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)[16]、高效液相色谱法[17-18]等。HU 等[19]利用高效液相色谱法检测已知大豆皂苷组分,但此方法需要昂贵的仪器。TLC 法是一种定性分析少量物质的一种主要的实验技术,该方法是根据不同的分析物质与固定相、流动相的亲和性不同,从而具有不同的迁移率进行分离[20]。TLC 可以同时分析多个样品,且不需要复杂的仪器,分析成本低,方法简单,结果可直接观察[21]。但采用的薄层色谱法检测大豆皂苷存在边缘效应,比如谱带丢失或拖尾现象,尤其是谱图中低聚糖区与皂苷区相互干扰。因此,对现有TLC 法进行优化,以确保其检测的准确性。

本研究主要通过对TLC 法展开剂配比、展开时间、点样量、展开温度、预饱和时间以及显色条件进行优化,建立一种TLC 法快速检测大豆皂苷的方法,并对20 个大豆材料皂苷类型进行分析,旨在为今后大豆皂苷特异种质的筛选和改良提供技术基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试大豆材料均由山西农业大学大豆育种室提供(表 1)。

表1 供试大豆材料名称和皂苷类型

大豆皂苷标准品 Aa(≥98%,HPLC)、Ab(≥98%,HPLC)、Ba(≥98%,HPLC)、Bb(≥98%,HPLC)购于成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

甲醇、氯仿、乙醇、冰乙酸、甲酸、石油醚(沸程为60~90 ℃)均为分析纯,购于天津市永大化学试剂有限公司。GF-254 硅胶板,购于青岛裕民源硅胶试剂厂。

震动研磨仪(北京格瑞曼仪器设备有限公司)、移液枪(广州市昕迪实验器材有限公司)、电子天平(深圳市铭科科技有限公司)、数显恒温水箱(金坛市新航仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 将大豆胚、子叶、种皮、茎、叶、根冷冻干燥,球磨仪磨成粉末,过0.42 mm 筛备用。

胚、子叶、根、茎、叶置于含0.01%乙酸的70%乙醇水溶液中室温浸提24 h,离心取上清,用2 倍体积的石油醚萃取脱脂,4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 标准溶液的制备 准确称取大豆皂苷标准品 Aa、Ab、Ba、Bb 各 1 mg,分别溶于 1 mL 甲醇,配成1 mg/mL 标准溶液,4 ℃保存备用。

1.3.3 薄层色谱条件的优化

1.3.3.1 展开剂的优化 在其他条件不变的情况下,通过改变展开剂配比(表2)考察了4 种展开剂对反应结果的影响。

表2 大豆皂苷展开剂配比

1.3.3.2 展开时间的优化 在其他条件不变的情况下,通过改变展开时间考察了4 个展开时间(30、50、70、90 min)对反应结果的影响。

1.3.3.3 点样量的优化 在其他条件不变的情况下,通过改变胚提取液的点样量考察了7 个点样量(2、4、6、8、10、12、14 μL)对反应结果的影响。

1.3.3.4 展开温度的优化 采用优化后的点样量和展开剂条件下,通过改变展开温度考察了4 个温度(20、25、30、35 ℃)对反应结果的影响。

1.3.3.5 预饱和时间的优化 采用优化后的薄层色谱条件,通过改变预饱和时间考察了4 个预饱和时间(0、30、60、90 min)对结果的影响。

1.3.3.6 显色条件的优化 采用优化后的薄层色谱条件,通过改变显色时间考察了4 个TLC 板在10%的 H2SO4溶液中浸泡时间(0、3、5、8 min)对显色结果的影响。

1.3.4 验证优化后的TLC 法 检测大豆皂苷的准确性和适用性,并对20 种不同大豆材料胚的大豆皂苷提取液进行分析。

2 结果与分析

2.1 展开剂和展开时间的优化分析

由图1 可知,4 种展开剂均可以将异黄酮、皂苷和低聚糖分离。已知展开剂、展开剂1、展开剂3 的大豆皂苷条带均有拖尾现象,分离效果差;而展开剂2 可以得到清晰的皂苷条带,分离效果较好,因此,选择展开剂2 为TLC 最佳展开剂。

从图 1 可以看出,展开时间为 30、50 min 时,大豆皂苷谱带分离效果不好;展开时间为70 min 时,各组分谱带分离明显,且无谱带丢失现象;展开时间为90 min 时,微量组分谱带模糊,所以,展开时间70 min 为TLC 法检测大豆皂苷最佳展开时间。

2.2 点样量的优化分析

从图2-A 可以看出,子叶提取液点样量为2、4、6、8 μL 时,含量少的谱带不显色;点样量为 10 μL时,分离度效果好,可以观察到所有谱带。由图2-B可知,胚提取液点样量为2、6 μL 时,弱带不显色;点样量12、14 μL 时产生拖尾,各条带变宽而发生重合,所以,子叶和胚点样量均为10 μL 是最佳点样量。

2.3 展开温度的优化分析

由图3 可知,展开温度为20、25 ℃时,迁移距离小,谱带分不开;展开温度为30 ℃时,谱带能较好地分离,且色谱图重复性好;展开温度为35 ℃时,谱带迁移距离相对较大,且色谱图不稳定。所以,最佳展开温度选择30 ℃。

2.4 预饱和时间的优化分析

从图4 可以看出,显色前如果不进行预饱和,TLC 板会产生边缘效应;预饱和时间为30 min 时,无边缘效应,且皂苷各组分谱带清晰;延长预饱和时间为60、90 min 时,谱带模糊。所以,预饱和时间30 min 为最佳预饱和时间。

2.5 显色条件的优化分析

从图5 可以看出,TLC 板未经10%的H2SO4显色溶液浸泡时,由于低聚糖谱带颜色深且紧邻皂苷谱带,对皂苷显色产生干扰;显色液中浸泡3 min 时低聚糖颜色变浅,且得到清晰的皂苷谱带;浸泡5、8 min 时,因显色时间过长,皂苷谱带颜色变浅,含量少的皂苷谱带不显色。所以,选择10%的H2SO4溶液中浸泡3 min 为最佳显色条件。

2.6 TLC 法检测大豆皂苷的准确性分析

从图6 可以看出,4 种大豆皂苷标准品和3 个样品均有较好的分离效果,且谱带清晰。样品谱带与标准品谱带进行对照,可以确定大豆材料皂苷的类型。

2.7 检测大豆皂苷适用性分析

利用优化的TLC 法对20 个大豆材料进行大豆皂苷组成分析,结果表明(图7),第一泳道晋大53和第8 泳道SNWS47 皂苷类型属于Ab 型皂苷,其他大豆材料均属于Aa 型。第4 泳道晋豆19 有2 条谱带,而其他材料至少有3 条谱,表明不同大豆材料胚中所含的大豆皂苷组分存在差异。

3 结论与讨论

张倩等[22]建立了TLC 法检测野生大豆皂苷展开体系,但其展开过程必须在10 ℃以下完成,否则会影响分离效果。本研究对TLC 检测大豆皂苷的展开剂配比、展开时间、点样量、展开温度、预饱和时间以及显色条件进行了优化,结果表明,展开剂为氯仿∶甲醇∶水∶甲酸=65∶38∶10∶0.01(V/V),展开时间 70 min,点样量 10 μL,展开温度 30 ℃,预孢和时间30 min,在10%的H2SO4溶液中浸泡3 min为最优条件。为了验证优化后的TLC 法检测大豆皂苷的准确性和适用性,对大豆皂苷标准品和20 个大豆材料皂苷类型进行了分析,证明该优化体系可以快速、准确地检测大豆皂苷类型。该方法可用于快速检测大豆种质资源皂苷类型。

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