王一凡 张璇 李军

淫羊藿苷(Icariin，ICA)是淫羊藿的主要提取物，具有加速细胞周期和促进骨髓干细胞成骨分化的作用[1-5]。近年来，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)因其独特的生物化学性质备受关注[6-7]。外泌体能负载蛋白质、脂类、核酸和植物提取物，并通过这些功能性物质的转运实现细胞间物质交换和信息传递[8]。本研究选用具有归巢潜能的间充质干细胞作为母细胞，首次将淫羊藿苷负载于外泌体中来实现ICA的缓释，明确ICA-EVs对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化作用，为ICA的成骨应用提供新思路。

1 材料及方法

1.1 材料

ICA从美国马萨诸塞州沃本市LC实验室购买，小鼠购自广东省医学实验中心。亲脂性荧光染料1，1′-十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐(DIL)和分子探针购于美国俄勒冈州尤金市。6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)和Triton X-100从Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯市)获得。细胞培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco生命科技公司。荧光聚苯乙烯(荧光最大值G100)来自赛默飞世尔科技公司(美国)。

1.2 EVs分离

从分化的小鼠成骨细胞中分离出EVs。在成骨细胞第6天，更换培养基，并在第7天收集培养基。将培养基分别以300g离心5 min和2×104g离心20 min，去除细胞和较小的细胞碎片。收集的上清液通过聚醚砜膜过滤器(0.22 μm，美国康宁)并以1×105g离心60 min。用PBS冲洗颗粒并重新离心(1×105g离心60 min)。悬浮在无菌PBS中的颗粒在4 ℃下保存，直到进一步使用。

1.3 ICA-EVs的制备

使用超声法将ICA装载到EVs中，将ICA和EVs混合物使用505型超声去膜器进行超声处理，设置如下：20%振幅，6个周期30 s开/关，持续3 min，每个周期之间有2 min的冷却期。超声处理后，ICA-EVs溶液在37 ℃下孵育60 min，以恢复外体膜。……