罗梅娟，胡家奇，魏颖，欧巧群，翁志媛，王丽娜，张又祥

广州市第一人民医院华南理工大学医学院附属第二医院儿科，广州510180

早产儿常伴随宫内感染、脓毒血症、呼吸窘迫综合征等并发症。近年来随着新生儿重症监护技术的发展，早产儿尤其是极早产儿（胎龄＜32 周）的存活率明显升高。但极早产儿因消化系统发育不成熟、胃肠分泌能力低下、肠道菌群紊乱等因素，在出生后喂养过程中极易出现喂养不耐受（feeding intolerance，FI）。近年来发现，FI 和肠道菌群存在紧密的关系，尤其早产儿早期喂养不耐受，与其肠道菌群定植延迟、种类缺乏，尤其是乳酸杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）缺乏有关。有别于传统的DGGE法、荧光定量PCR法等检测肠道菌群，高通量测序技术通过细菌16S rDNA 的不同特异区段进行扩增和测序，进而获得更多的高质量的菌群基因组信息。随着高通量技术的发展，肠道菌群在极早产儿中的作用渐渐被肯定，在极早产儿的免疫性疾病、过敏性疾病、代谢等方面均发挥重要作用［1，2］。本研究采集FI 的极早产儿胎粪进行高通量测序，分析其肠道菌群的特征。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年12月间广州市第一人民医院住院的早产儿24 例。极早产儿纳入标准［3］：①胎龄＜32周；②胎盘病理诊断完整；③同意参加本研究。极早产儿排除标准：①存在先天畸形或者染色体异常；②出生后因病情危重或其他因素放弃治疗或死亡。FI 诊断标准：①喂养3 h后胃内残留量仍大于上次喂养量的50%，且每次喂养量均不小于下列各体质量范围的最低喂养量（体质量＜500 g者2 mL、500～749 g 者3 mL、750～1 000 g者4 mL、＞1 000 g 者5 mL）；②呕吐≥3 次/天；③胃残液或呕吐物为咖啡样液体；④禁食＞2 次/天；⑤腹胀（腹围24 h内增加≥1.5 cm，有肠型）、胃内残留或呕吐胆汁样物、大便潜血阳性均需同时合并其他FI 症状。符合上述情况之一明确诊断为FI［4-5］。24 例极早产儿中喂养耐受（feeding tolerance，FT）组8 例，其中男4 例、女4 例，出生周龄为（30.62±1.05）周，出生体质量为（1 426.25±255.48）g；FI组16例，其中男9例、女7例，出生周龄（30.25±1.17）周，出生体质量为（1 400.62±188.74）g。两组性别、出生周龄和出生体质量具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 两组出生时胎粪中肠道菌群检测及菌群丰度测算 两组患儿出生24 h内使用无菌粪便采集管收集患儿粪便，-80 ℃冰箱冻存，利用Qiagen 公司Stool DNA 提取试剂盒提取粪便DNA，DNA 提取完成后行琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度和浓度，无降解、无RNA 污染、杂带为合格样本，合格DNA 用无菌水稀释至1 ng/μL。以稀释后的DNA 为扩增模板，引物为16SV4 区段515F-806R（F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 806：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）反应程序设置为：98 ℃预变性1 min；30 个循环（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min，使用New England Biolabs 公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 进行扩增，所得PCR 产物用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测质量）；选择主带大小在400～450 bp之间的序列，进行胶回收目标条带。产物纯化使用Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒。

1.2.1 两组肠道菌群chao 1 指数、shannon 指数测算 采用高通量测序法。使用New England Biolabs公司的NEB Next® Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 3.0 荧光定量仪定量和文库检测合格后，使用HiSeq 2500系统进行上机测序。测序完成后原始数据拼接、过滤，以及基于有效数据进行操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析，根据OTUs 聚类结果，对每个OTUs 的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。

使用Qiime 软件（Version 1.9.1）计算chao1 指数和Shannon 指数，chao1 指数［6］主要关心样本的物种丰富程度，表示预测的OTUs 个数；Shannon 指数［7］综合体现物种的丰富度和均匀度，故指数的高低还会受均匀度影响，样本中的物种分布越均匀，多样性越高。

1.2.2 两组肠道菌群相对丰度测算 根据OTUs聚类结果，对每个OTUs 的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。采用RDP classifier Bayesian 模型［8］对OTU 进行分析，基于SILVA［9］和Greengene［10］数据库统计样本门、科、属等水平的肠道细菌相对丰富，分析细菌的特征。菌群分析及测算由北京诺禾致源生物信息科技有限公司提供技术支持。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理，Adobe Illustrator CS5 和Graphpad Primer 7.0 软件分析绘图。计数资料用例表示，Shapiro-Wilk 法行正态性检验和Bartlett 法行方差齐性检验；计量资料以xˉ±s 或者M（Q1，Q3）表示，满足正态分布及方差齐性后两组样本采用独立样本t检验分析，不符合者采用Wilcoxon 秩和检验分析性别差异采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肠道菌群chao 1 指数、shannon 指数比较FI 组、FT 组chao 1 指数分别为1 538.56 ± 545.72、1 052.50±106.86，P＜0.05。FI 组、FT 组shannon 指数分别为7.06±1.51、5.62±1.37，P＜0.05。

2.2 两组肠道菌群相对丰度比较 FI 组、FT 组门水平上变形菌门（Proteobacteria）相对丰度分别为0.214 913（0.054 596，0.345 245）、0.585 904（0.068 144，0.688 192），厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度分别为0.424 363（0.305 997，0.545 460）、0.288 521（0.179 652，0.540 196），Cyanobacteria相对丰度分别为0.007 401（0.002 593，0.013 151）、0.001 944（0.000 947，0.004 179）、拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度分别为0.189 504（0.067 325，0.339 956）、0.113 030（0.032 838，0.276 445），放线菌门（Actinobacteria）相对丰度分别为0.026 416（0.012 754，0.048 859）、0.015 837（0.010 629，0.030 209），、无壁菌门（Tenericutes）相对丰度分别为0.003 541（0.002 008，0.010 732）、0.002 320（0.000 447，0.004 332），Acidobacteria相对丰度分别为0.003 101（0.001 096，0.004 459）、0.000 617（0.000 422，0.001 203）、未分类菌门（unidentified_Bacteria）相对丰度为0.008 053（0.002 242，0.012 186）、0.002 874（0.001 103，0.006 407），Verrucomicrobia相对丰度分别为0.004 903（0.003 087，0.005 545）、0.001 270（0.000 631，0.003 051），Chloroflexi 相对丰度分别为0.001 547（0.000 404，0.002 278）、0.000 220（0.000 124，0.000 582），其他菌门（Others）相对丰度分别为0.014 432（0.009 767，0.021 013）、0.005 109（0.003 548，0.007 042）。与FT 组比较，FI 组Cyanobacteria、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Others 相对丰度均增加（z 分别为-2.572，-2.267，-3.307，-2.664，-2.694；P＜0.05）。

FI 组、FT 组科水平上unidentified_Cyanobacteria相对丰度分别为0.007 103（0.002 483，0.010 664）、0.001 916（0.000 898，0.003 927），未分类的梭菌科（unidentified_Clostridiales）相对丰度分别为0.006 705（0.004 183，0.011 612）、0.005 080（0.002 476，0.008 582），消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）相对丰度分别为0.005 691（0.004 349，0.009 316）、0.004 491（0.002 934，0.006 677），毛螺菌科（Lachnospiraceae）相对丰度分别为0.126 646（0.038 241，0.195 766）、0.047 901（0.020 900，0.106 516），瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相对丰度分 别 为0.077 908（0.022 794，0.126 142）、0.028 069（0.011 878，0.079 476），Others 相对丰度分别为0.514 787（0.367 003，0.610 660）、0.315 008（0.144 328，0.485 203），肠杆菌科（En-terobacteriaceae）相对丰度分别为0.023 791（0.014 400，0.074 555）、0.066 236（0.013 166，0.611 001），肠球菌科（Enterococcaceae）相对丰度分别为0.024 635（0.013 471，0.071 589）、0.048 433（0.012 868，0.092 918），链球菌科（Streptococcaceae）相对丰度分别为0.008 245（0.004 672，0.014 918）、0.025 614（0.003 200，0.055 497），伯克氏菌科（Burkholderiaceae）相对丰度分别为0.010 395（0.004 970，0.048 923）、0.004 009（0.002 75，0.141 288），鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）相对丰度分别为0.002 583（0.002 153，0.021 336）、0.002 114（0.001 249，0.122 215）。与FT 组比较，FI组unidentified_Cyanobacteria、Others 相对丰度均增加（Z分别为-2.572，-2.176；P＜0.05）。

FI组、FT组属水平上，对相对丰度前100的菌属进行两组间的统计检验，筛选出7 种差异细菌。unidentified_Cyanobacteria相对丰度分别为0.007 103（0.002 597，0.009 856）、0.001 916（0.001 359，0.002 728），Pseudomonas相对丰度分别为0.001 384（0.000 614，0.003 441）、0.000 532（0.000 429，0.000 791），Catellicoccus相对丰度分别为0.000 156（0.000 039，0.000 341）、0.000 000（0.000 000，0.000 043），unidentified_Lachnospiraceae相对丰度分别为0.034 384（0.008 993，0.046 156）、0.012 013（0.006 059，0.021 563），Massilia相对丰度分别为0.000 319（0.000 124，0.000 983）、0.000 085（0.000 046，0.000 099），Cellulomonas相对丰度分别为0.000 057（0.000 014，0.000 170）、0.000 000（0.000 000，0.000 000），Oceanobacter相对丰度分别为0.000 000（0.000 000，0.000 004）、0.000 050（0.000 011，0.000 078）。与FT 组比较，FI 组肠道unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Catellicoccus、unidentified_Lachnospiraceae、Massilia和Cellulomonas相对丰度升高，Oceanobacter相对丰度降低（Z分别为-2.572，-2.205，-2.233，-2.347，-2.728，-2.770，-2.053；P均＜0.05）。

3 讨论

健康人的肠道中有超过1014个的细菌数量，菌群种类在1 000种以上，肠道细菌数量和菌群种类保持一定的动态平衡，有利于维持机体健康，同时肠道菌群也被誉为人类“隐形的器官”［11］。肠道菌群失衡会导致炎症性肠病、代谢综合征、神经认知发育异常等疾病。近年来提出的“重视生命阶段早期的菌群特征”并在疾病早期进行干预，也是肠道微生态研究的重要方向。

早产儿作为特殊的群体，受出生胎龄、出生体质量、出生后喂养情况、抗生素应用等多因素影响，存在菌群定植能力低下、肠道菌群屏障构建迟滞、多样性下降等问题［12］。近年来随着新生儿重症监护病房呼吸、营养等支持条件的进步，极早产儿的存活率显著提高，但同时也渐渐显露出许多临床问题，由于胎龄＜32 周早产儿平滑肌发育不成熟、胃肠道激素分泌和消化酶活性差等原因，出现FI 的极早产儿消化系统问题则更为突出［4］，一旦出现菌群结构失调，可能会导致如坏死性小肠结肠炎的发生，甚至败血症、过敏性疾病以及代谢性疾病等其他肠外系统疾病的发生。极早产儿除胎龄因素外，FI 也一直是临床医生关注的方面，尽管肠道菌群与FI 的关系在国内外的许多研究中得到肯定，但关于极早产儿群体的研究却很少。为此，我们选取2018 年1 月—2019 年12月在广州市第一人民医院住院的早产儿为研究对象。根据极早产儿和FT/不耐受的标准入组，将极早产儿分为FT 组和FI组。为高效、快速、全面分FT极早产儿和FI极早产儿的菌群特征，本研究采取Illumina 高通量测序技术，基于16S rDNA 的微生物群落分析原则，对极早产儿出生后24 h 内胎粪中的微生物物种进行分析，估算其微生物种的多样性、丰度和物种构成，进而探索FI 极早产儿出生菌群的特征并获得以下发现：FI极早产儿肠道菌群多样性较FT极早产儿显著升高，且Cyanobacteria门、Acidobacteria门、Verrucomicrobia门、Chloroflexi门、unidentified_Cyanobacteria科、unidentified_Cyanobacteria属、Pseudomonas属、Catellicoccus属、unidentified_Lachnospiraceae属、Massilia属和Cellulomonas属在FI 组中显著富集，并且在门水平和科水平，非优势菌门/科（Others）在FI 组显著增加，提示FI 极早产儿肠道菌群多样性的增加可能与条件致病菌/非常驻菌的相对丰度显著增加有关。

极早产儿出生胎龄小，肠道菌群未发育成熟，尤其是常驻的优势菌增殖能力不健全，并且剖腹产患儿，在相对无菌的出生条件中原驻菌丰度较经阴道分娩低，伴随出生存在的致病因素，条件致病菌丰度可能会增加。其中Cyanobacteria竞争性抑制其他常驻菌能力强，在无氧条件下能较好生长，并且破坏肠腔内无氧/微氧条件，可能与极早产儿消化道症状有关。Cyanobacteria产生的β-甲基氨基-1-丙氨酸及其最常见的结构异构体2，4-二氨基丁酸和N-2-氨基乙基甘氨酸能够引起肠神经功能紊乱；Pseudomonas则是临床中常见的新生儿宫内感染病原菌［13］，可以介导早产儿肺炎、眼部感染、咽峡炎、甚至败血症等多种感染［14-16］；Massilia是与感染性角膜炎、中耳炎有关的条件致病菌［17-18］；Cellulomonas则是近年来新发现的与败血症、感染性心内膜炎、胆管炎发生相关的致病菌［19-20］；Lachnospiraceae是人类肠道菌群中富集菌科，与短链脂肪酸的产生有关，可以为肠上皮提供能量，同时影响Treg/Th17 比值，介导肠道免疫反应［21-22］。此外，本研究中还发现了Catellicoccus和Oceanobacter两种报导较少的海洋菌，人类疾病的研究极少，二者在早产儿FT情况中的研究仍需进一步探索。

基于我们的研究，FI 极早产儿的肠道菌群特征有其特殊性，既往研究［23］发现，FI 早产儿在未发生FI 前菌群多样性个体差异较大，但大多提示FI 早产儿的多样性下降，本研究中发现极早产儿的多样性反而增高，可能是由于FI 极早产儿肠道菌群中致病菌相对丰度增加所致。FI 早产儿致病菌增多［如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）］而Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌减少，并且克雷伯氏菌属（Klebsiella）与FI 症状显著相关，同时较大胎龄的早产儿在益生菌丰度下降方面比致病菌增加更显著［24-25］。而本研究纳入的极早产儿较以往早产儿菌群研究中的纳入对象出生胎龄小，表现为Cyanobacteria门、Lachnospiraceae科、Cellulomonas属、Pseudomonas属、Massilia属等条件致病菌或者介导肠道免疫反应的细菌显著富集。由此可见，对于极早产儿临床诊疗过程中，应该更关注条件致病菌的增加问题，极早产儿不同于较大胎龄的早产儿，其肠道菌群结构更薄弱，对于致病菌的抵抗力更低，对于极早产儿而言，在早期（出生时）应用抗生素和补充Lactobacillus、Bifidobacterium等益生菌更为迫切，因为Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等细菌的繁殖能力强，对常驻菌的竞争性抑制作用强烈，更容易介导肠道菌群紊乱。此外，对于极早产儿粪便菌群的检测，关注Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等细菌的相对丰度，有利于预判FI的发生，及早进行配方奶、益生菌等干预。

但本研究系小样本的研究，存在一定偏倚，且采集样本的节点只有出生24 h 以内一个，无法动态分析极早产儿肠道菌群的变化及其与FT程度的关系。在后续的研究中完善大样本的临床数据调查和样本分析，增加多个采集样本的节点，深入致病菌的具体作用分子机制仍需不断探索。

综上所述，FI 的极早产儿出生时肠道菌群的多样性下降，Cyanobacteria、Cellulomonas、Pseudomonas、Massilia等菌群富集明显。Cyanobacteria、Cellu-lomonas、Pseudomonas、Massilia等条件致病菌的菌群变化可能是极早产儿出现FI 的原因。在临床工作中需关注极早产儿肠道菌群建立的因素，特别是条件致病菌的影响，并且采取有效措施及早建立正常的肠道菌群，减少FI 的发生，同时及早运用抗生素、适当补充益生菌是重要的干预手段。